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1、本科学生实验报告学号 104120440 姓 名 孙永升学院 生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称酶工程 教师及职称李俊俊开课学期2012至 2013学年第二学期 填报时间2013 年 5 月 29 日云南师范大学教务处编印实验名称实验方式小组成员XXXX实验六 纤维素酶的固定化及其性质测定小组合作XXXX1、实验目的1.1 了解酶制剂的固定化方法；1.2学会固定化酶酶学特性的测定方法。2、实验仪器、试剂和溶液：2.1仪器：紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移液管、洗耳球、 注射器、标签（若干）等。2 .2试剂和溶液2 .2.1 柠檬酸钙缓冲液，0.05m
2、ol/L, pH4.8;2 .2.2 10mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）；2 .2.3 DNS试剂（CMCA-DNS）;2 .2.4稀释到200倍的纤维素酶液；2 .2.52.5%、3.5%、4.5%、5.5%的海藻酸钙溶液；2 .2.6 2%的CaCl 溶液。23、实验原理或装置示意图：3.1酶的固定化把游离的水溶性酶限制在某一局部空间或固体载体上，酶固定后既不会流失，也不会污 染产品，而且稳定性得到提高可长期反复使用。3.2最常用的固定化方法是包埋法。3.3海藻酸钙包埋法：通常是在其钙盐溶液中加入二价离子（如Ca2+），通过Ca2+取代Na+来形成凝胶网络。4、实验方法步骤、操作
3、流程及注意事项：4 .1实验方法：（一）酶液的准备（二）纤维素酶的固定化（三）固定化纤维素酶性质的测定4 .2实验操作步骤：1、将预先准备好的200倍纤维素酶液酶准确稀释：固定化酶稀释到1000倍，测游离酶稀 释到10000倍待用。2、纤维素酶的固定化：各取四瓶200mlCaCl溶液于500ml三角瓶中待用。各取30ml不同2浓度（2.5%、3.5%、4.5%、5.5%）的海藻酸钙于50ml小烧杯中，并分别取取稀释到 1000倍的纤维素酶液10m l加入不同浓度的海藻酸钙溶液中，混合均匀。3、用注射器将上述混合液取20ml （各取四次）逐渐滴入200mlCaCl溶液的三角瓶中2静止冷却20mi
4、 n后，经固定化的小球纱布过滤晾干待用。4、准确称取各个浓度制成的海藻酸钙纤维素酶0.5g固定化小球，游离酶量取0.5ml, 60C预热10min。5、准确计时后，于保温后的酶液中依次加如CMC-Na溶液2.00mL振荡混匀，在50C水浴 中继续保温30min （准确计时）。（固定化酶对照中不加入底物、游离酶对照中先不加入酶液）6、反应混合物物保温30min后，于各个浓度底物试管中加入3mLDNS试剂终止液，迅 速振荡均匀。（1）于游离酶对照中加入0.5 ml的酶液。（2）于固定化酶对照中加入2.00mLCMC-Na溶液。7、混合后将各个实验组的三支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水1
5、9.5mL。摇 匀，在540nm处读取OD值。8、固定化酶与游离酶稳定性比较（操作按上面所述）：将得到的固定化纤维素酶（海藻 酸钙浓度为3.5%）与等量的游离纤维素酶分别在60C下保温10min、20min、30min、 40min、50min，保温后按标准方法进行酶活测定（分别做三个平行）。9、海藻酸钙浓度对酶活性的影响：分别用2.5%、3.5%、4.5%和5.5%的海藻酸钙浓度来固定化酶，并分别测定固定化酶的活性（分别做三个平行）。4.3实验注意事项本实验耗时长在测定中尽量减少操作错误：应熟知流程、步骤。另：实验所测定内容较 多，因此应小组分工合作配合完成。注意以下事项： 酶液准确稀释。移
6、液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； 在纤维素酶固定化测定中是底物加入酶液：空白对照先不加底物，游离酶测定中空白 对照先不加酶液。 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； 避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5、实验结果与数据处理：5.1实验数据与结果:表一固定化酶（3.5%）与游离酶稳定性的比较吸光度OD閱酶活（u/g）、相对酶活（%）540、保温时间（min）固定化纤维素酶酶游离纤维素酶酶100.0375639.0433.630.05857586.5065.23200.25901900.611
7、00.000.06958213.0170.62300.19651544.6481.270.08058839.5376.00400.13731207.4663.530.129511630.36100.00500.0570653.4634.380.07556008.0051.66注：固定化酶所用源酶液稀释1000，相对酶活以1900.61 u/g为100%计算；游离酶10000倍, 相对酶活以11630.36u/g为100%计算.表二不同海藻酸钙浓度的固定化酶的活性海藻酸钙浓度（%）吸光度OD540固定化纤维素酶活（u/g）相对酶活（%）2.50.0295593.4863.853.50.08859
8、29.52100.004.50.0390741.1579.735.50.0297601.5964.72注：相对酶活以本组测定酶活最高929.52 u/g为100%计算.5.2结果处理一经统计软件作图分析结果如下：5.2.1固定化酶(3.5%)与游离酶酶活稳定性的比较如图一、20-固定化纤维奈相对输活析游离纤维奈相对输活分纽保温时间(min)1002L-o-相对爾活()固定化纤维索相对曲活訴I湧离纤维盘相对曲活固定化纤维索相对篦话两谕离纤维秦相对的活保温时间(min)864和对朋活(K)图一图二)3.5%海藻酸钠的固定化纤维素酶与游离纤维素酶相对活性0204060图三5.2.2不同海藻酸钙浓度固
9、定化酶的纤维素酶相对活性如图四:不同浓度的海藻酸钙对固定化纤维素酶相对活性影响图四结果： 酶活（相对酶活）比较：固定化酶（3.5%）与游离酶酶活稳定性由图一、二、三可以看出：海藻酸钙（3.5%）所制成的纤维素固定化酶相对活性随反应时间 的增加在20min时到达最大100%,后逐渐减小。曲线在30min时与游 离纤维素酶曲线有一个交点：时间增加固定化酶活性降低，40min时, 纤维素游离酶活性达最大相对活性：100%，之后减低，酶相对活性远 远高于固定化酶相对活性。 酶稳定性比较：由图三可看出在反应30min以后，游离酶的酶活稳定性保持升高到40min达最大酶活，之后酶活（相对活性）急剧下降（曲
10、线斜率较陡曲）; 而固定化纤维素酶的酶活从20min后保持平缓的下降趋势（斜率较缓）, 即稳定性较高。 不同浓度的海藻酸钙对固定化酶性质影响： 随着海藻酸钙的浓度由：2.5%、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈现增后减的趋势，固定化纤维素酶酶活性在3.5% 达最大相对酶活性100%。6、分析与讨论：酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并 可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反 应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使 用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶
11、的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。 优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。实验中所采用的 时物理包埋法，采用海藻酸钙介质包埋纤维素酶制成固定化纤维素酶。（一）纤维素固定化酶与游离酶活性比较初步得出结论：3.5%海藻酸钙固定所制得的酶到 最大反应时其反应时间（20min）明显短于游离酶的反应时间（40min）;反映出固定化 酶的优势之一。（二）在探索不同海藻酸钙浓度对固定化纤维素酶活性影响中，可以看到随浓度的增加酶 相对活性先增后减在3.5%时最大。由此我们初步确定海藻酸钙固定纤维素酶的最适 浓度。（三）有实验发现经固定化后纤维素
12、酶的活性降低，但固定化酶的增加稳定性（温度60t, 不同时间）与游离酶相比较增加。对于固定化酶活性受各种因素所影响：海藻酸钙的浓度、氯化钙的浓度、纤维素酶用量、 固定化时间等。因此为确定固定化纤维素酶所用海藻酸钙准确浓度需进一步试验采用单因子 变量。由图四可知，在海藻酸钙浓度（质量分数）为3.5%时，固定化酶活力最大。当海藻酸钙 质量分数过大时,其黏度很大，难以挤成球状，影响凝胶成型，同时凝胶的孔径也小，影响酶 与底物的结合。反之海藻酸钙质量分数太小，凝胶的孔径较大，固定化酶容易流失，也会影响 酶活。因此，合适质量分数的海藻酸钙易形成机械强度适宜的凝胶，同时底物和产物易于从凝 胶微孔扩散通过，
13、酶促反应速度较快，所以选择海藻酸钙浓度（质量分数）3.5%为宜。对酶固定化后酶稳定性提高的原因可能有以下几点： 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶伸展变形； 酶活力的缓慢释放； 抑制酶的自降解，将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从 而抑制了降解。7、实验小结： 掌握海藻酸钙固定纤维素酶的基本原理与操作方法纤维。 在海藻酸钙固定纤维素酶中由于固定化效果受各种条件影响：海藻酸钙的浓度、氯化钙 的浓度、纤维素酶用量、固定化时间等。因此实验中严格控制除海藻酸钙钙外的因素。 做到准确，减少实验操作误差，增加结果可信度。8、实验思考题：I为什么海藻酸钙浓度的固定化酶的活性产生影响
14、？答：固定化条件对固定化酶活力的影响主要有：海藻酸钙的浓度、氯化钙的浓度、纤维素酶用量、固定化时间等。海藻酸钙具有强烈的吸附作用，可与Ca2+、Cu2+等正二价阳离子迅速形成凝胶，海藻酸钙浓度过大凝胶的空径越小，影响酶与底物结合；海藻酸钙浓度太小，凝胶的孔径较大，固定化容易流失，所以酶活较低。所以海藻酸钙浓度有一个最佳浓度值。II为什么海藻酸钠浓度的固定化酶的活性产生影响？答：固定化条件对固定化酶活力的影响主要有：海藻酸钠的浓度、氯化钙的浓度、纤维素 酶用量、固定化时间等。海藻酸钠具有强烈的吸附作用，可与Ca2+、Cu2+等正二价阳离子迅 速形成凝胶，海藻酸钠浓度过大凝胶的空径越小，影响酶与底物结合；海藻酸钠浓度太小， 凝胶的孔径较大，固定化容易流失，所以酶活较低。所以海藻酸钠浓度有一个最佳浓度值。9、参考文献：1 鲁玉侠，蔡妙颜，郭祀远，王兆梅.海藻酸钙包埋法制备固定化脂肪酶研究J.现代食品 科技,2007,4(22):3032.2 潘利华，罗建平，查学强等.海藻酸钠固定化仿葡萄糖苷酶的制备及其性质研究J.合 肥工业大学学报(自然科学版)，2007,10(30): 13321335.张琛，张宽朝，章琛，缪伟.海藻酸钙包埋法制备固定化菠萝蛋白酶J.生物加工 程，2009, 6(7):3134.4王华，王莹，李爱娟等.海藻酸钙交联包埋法固定化纤维素酶研究J.江苏农业
