《免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1 、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理， 每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、 37 度，我推荐4 度最佳，反应最温和，背景较浅；而37 度反应速度较快，时间较短； 室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。2、免疫组化最大的优势是定位和定性。 相比于其他蛋白检测
2、方法，免疫组化具有定性灵敏度高、 定位较直接准确， 是定位检测分析首选方法。 尤其对于有些因子的转位研究十分有用。3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确， 这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做； 阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发 SC
3、I 论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎， 可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤， 重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。7、实验方法需要动手+动脑 。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这
4、说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。一、概念和常用方法介绍1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（ immunohistochemistry ）技术或免疫细胞化学（ immunocytochemistry ）技术。2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合， 再利用一抗与标记生物素、 荧光素等的二抗进行反应， 前者再用标记辣根过氧化物酶（ HRP）或碱性磷酸酶（ A
5、KP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分， 在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物， 从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。3、分类1 ）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶- 抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如
6、卵白素- 生物素 - 过氧化物酶复合物（ ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白- 过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法； 聚合物链接， 如即用型二步法， 此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍1 ）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。 它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊
7、断、检验中应用较广。2）免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒， 通过光镜或电镜， 对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确， 对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、 SP 三步法、即用型二步法
8、检测系统等。3）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、 二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子( 如葡萄球菌 A 蛋白 )等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒， 且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。 由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。5、被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质
9、、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。6、特点1 ）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此， 免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（ keratin）显示上皮成分， LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。 2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或 SP三步法的出现， 使抗体稀释上千倍、 上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原
10、反应， 使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3）定位准确、形态与功能相结合。 该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位， 因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。7、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA 的异同 1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然 Western blottin
11、g也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。2）ELISA：酶联免疫吸附试验， 也是利用抗体 - 抗原 - 抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。二、实验流程简介改变程序； 应在暗室中进行检查； 防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以12h 为宜，超过 90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35min 后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以
12、最多不得超过23h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时， 须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启 15-30分钟后； 标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。已有的常见免疫组化难题集锦1、石蜡切片和冰冻切片的比较？（ 1
13、）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片； 但是要求做石蜡切片的， 可作冰冻切片。（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。 缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散； 切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-8
14、0度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4 微米左右， 所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功， 而且得到的颜色 / 形态都较冰冻切片好。2、一抗的选择要点和技巧是什么？（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合， 就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体， 形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。 在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。（ 2）应用范围的选择。有的一抗只能
