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1、SNPSNP检测技术检测技术PPTPPT讲座讲座内容简介1 SNP 概概 念念2 SNP 特特 点点3 SNP 检 测 技技 术4 实 验SNP 的概念 p单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。p它包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失等形式SNP在基因组内的形式:p一是遍布于基因组的大量单碱基变异;p二是分布在基因编码区(codingregion),称其为cSNP，属功能性突变。
2、SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：（1）非转录序列要多于转录序列（2）在转录区非同义突变的频率,比其他方式突变的频率低得多。SNP 的特点 p在遗传学分析中,SNP作为一类遗传标记得以广泛应用,主要源于这几个特点:（1）密度高SNP在人类基因组的平均密度估计为11000bp,在整个基因组的分布达3106个,遗传距离为23cM,密度比微卫星标记更高,可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。（2）富有代表性某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。SNP 的特点（3）遗传稳定性与微卫星等重复序列多态性标记相比
3、,SNP具有更高的遗传稳定性。（4）易实现分析的自动化SNP标记在人群中只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个“+-”或“全无”的方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。一、SNPs经典检测方法p一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如:1.限制性片段长度多态性法PCR-RFLP;2.单链构象多态性法PCR-SSCP;3.变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);4.等位基因特异性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等
4、PCR-RFLP方法 原理：原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。特点：特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一.PCR-RFLP原理图单链构象多态性(SSCP)原理：原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和
5、RNA分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。变性梯度凝胶电泳（DGGE）p原理：原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。电泳开始时,DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关,而一旦DNA泳动到某一点时,即到达该DNA变性浓度位置时,使得DNA双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时,DNA片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱基组成有
6、差异,使得其变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条带。等位基因特异 PCR(AS-PCR)原理：原理：根据SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。SNPs高通量的检测方法另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通量、自动化程度较高的检测SNPs的方法,较为常用的有:1.DNA测序法;2.DNA芯片检测;3.飞行质谱仪(M
7、ALDI-TOFMS)检测;4.变性高效液相色谱(DHPLC)法等等DNA测序法p直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理原理:通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%。特点：特点：可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。基因芯片技术(Genechips)原理原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。特点：特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的突出优点。但它也存在若干问题:芯片造价高昂,所需设备贵重
8、,不利于普及应用。MALDI-TOF 原理：原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。变性高效液相色谱(DHPLC)原理：原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容
9、易从色谱图中判断出突变的碱基。特特点点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。MassARRAYpSNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱质谱技术相结合，实现基因分型检测。p基于MassARRAY分子量阵列平台的iPLEXGOLD技术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。
10、特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。MassARRAY技术原理技术原理:p先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。MassARRAY技术原理技术原理:pMassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一
11、个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。MassARRAY技术流程：技术流程：应用：应用：1.确定基因多态性和疾病的关系2.解释个体间的表型差异对疾病的易感程度3.对未来疾病做出诊断4.研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开发及临床合理用药5.个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进行法医鉴定及个体识别优势p（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；p（2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；p（3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔；p（4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器；p（5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；p（6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说的4重反应；p（7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。p（8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。
