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1、WesternbloWesternblot t原理和技原理和技术术PPTPPT讲座讲座n为什么要作蛋白质印迹实验？为什么要作蛋白质印迹实验？q研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中在样品当中q蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。定义：n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜
2、）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Towbin,H.,et al.(1979).Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications.Proc.Nat
3、l.Acad.Sci.USA 76,4350-4354.Western Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blotting 方法一:直接法n优点：q1.快速（一种抗体）q2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带n缺点：q1.免疫反应性降低q2.无信号二级放大q3.抗体标记费时昂贵,使用不方便Western Blotting 方法二:间接法n优点：q1.免疫特异性不受标记影响q2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）q3.多种标记的二抗可供选择q4.可选择不同的Markern缺点：q1.交叉反应引起的
4、非特异性条带q2.额外的二抗孵育以及条件优化间接Western Blotting操作流程:Western Blot一般流程n蛋白样品的制备nSDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色Western Blotting 设计选择设计选择n分子量标准n内参n膜n转膜和封闭n抗体n显色不可小看不可小看“蛋白标准蛋白标准”-分子量标准的选择n预混分子量标准q高分子量标准q低分子量标准q宽分子量标准n预染分子量标准q单色预染q多色预染n修饰分子量标准预混分子量标准n高分子量标准n低分子量标准n宽分子量标准预染分子量标准n单色预染n多色预染修饰分子量标准n糖基化n磷酸化n荧光标记不
5、可不加-内参的选择n原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差 n种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin n用法：q二抗孵育时加入HRP标记内参抗体 q分子量相差不大 q分子量大小相差比较明显 原料是基础-膜n选择种类qNCqPVDFq尼龙膜n选择标准qa.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；qb.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；qc.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜膜的特点 抗体的选择n作为western来讲，理
6、论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。八仙过海，各八仙过海，各“显显”神通神通-显色方法n化学显色法:方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测n化学发光法:灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测n同位素法:灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短n荧光底物法：Krypton 荧光底物两种常用检测酶系统的比较掌握nWestern blotting的原理和主要步骤。
