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1、实验十 细菌的生理生化反应一、目的1.11.1了解细菌鉴定中常用的生理生了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理化试验反应原理1.21.2掌握测定细菌生理生化反应的掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法技术和方法二、原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。不同微生物因具有不同的酶系统，分解利用不同微生物因具有不同的酶系统，分解利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，其糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，其发酵的类型和产物也不相同。细菌的生理生发酵的类型和产物也不相同。细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中有很大作用。化反应在菌株的分类鉴定中有很大作用。三
2、、材料3.1菌种菌种大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichiacoli）产气肠杆菌（产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）普通变形杆菌（普通变形杆菌（Proteusvulgaris）枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的斜面菌种的斜面菌种3.2培养基培养基糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基、H2S试验培养基、柠檬酸盐培养试验培养基、柠檬酸盐培养基基3.3试剂试剂V.P试剂、试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、甲基红试剂、吲哚试剂、
3、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、溴甲酚紫指示剂、碘液。碘液。3.4器具器具恒温培养箱、试管、移液管、杜氏小管。恒温培养箱、试管、移液管、杜氏小管。四、步骤(一一)糖类发酵试验糖类发酵试验（二）（二）乙酰甲基甲醇试验乙酰甲基甲醇试验(V(VP P试验试验)（三）（三）甲基红试验（甲基红试验（M.R.M.R.试验）试验）（四）（四）吲哚试验吲哚试验（五）（五）柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验 （六）（六）硫化氢试验硫化氢试验（七）（七）淀粉水解试验淀粉水解试验(一)糖类发酵试验原理原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。鉴定
4、菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂，是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂，经培养后根据指示剂的颜色变化来判断经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察培养基中放入倒置杜氏小管观察。材料材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌菌种：大肠杆菌、变形杆菌培养基：葡萄糖发酵培养液、乳糖发酵培养液试管培养基：葡萄糖发酵培养液、乳糖发酵培养液试管步骤步骤1试管标记试管标记取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、普通变形菌。试管中均分别标记大肠杆菌、普通
5、变形菌。2接种培养接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中。置以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中。置37恒温箱中培养，培养恒温箱中培养，培养24h-48h，观察结果。，观察结果。取出以上试管，振荡取出以上试管，振荡2min。加入等量。加入等量V.P试剂；振荡试管，以使试剂；振荡试管，以使空气中的氧溶入，置空气中的氧溶入，置37恒温箱中保温恒温箱中保温1530min。若培养液呈红色，记录为若培养液呈红色，记录为V.P.试验试验阳性反应（用阳性反应（用“”表示）；表示）；若不呈红色，记录为若不呈红色，记录为V.P.试验阴性试验阴性反应（用反应（用“”表示）。表示）。结果观察结
6、果观察（三）（三）甲基红试验（甲基红试验（M.R.试验）试验）原理原理肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至值下降至pH4.2以下，使甲基红指示剂变红。以下，使甲基红指示剂变红。材料材料菌种菌种同同V.P试验试验培养基培养基同同V.P试验试验步骤步骤同同V.P试验试验1标记试管标记试管:取取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试
7、管，分别标记大支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置置37恒温箱中，培养恒温箱中，培养2448h。取出以上试管，各加入取出以上试管，各加入23滴甲基红指示滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层。上层。n若培养液上层变成红色，即为阳性反应，若培养液上层变成红色，即为阳性反应，用用“”表示；表示；n若仍呈黄色，则为阴性反应，用若仍呈黄色，则为阴性反应，用“”表示。表示。结果观察结果观察（四）吲哚试验原
8、理原理:有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入吲哚试剂吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛试剂）时，该试剂与吲哚作用，形成红（对二甲基氨基苯甲醛试剂）时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。色的玫瑰吲哚。材料材料菌种：同菌种：同VP试验试验培养基：蛋白胨水培养基培养基：蛋白胨水培养基试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。步骤步骤1试管标记试管标记:取装有蛋白胨水培养液的试管取装有蛋白胨水培养液的试管2支，分别标记大支，分别
9、标记大肠杆菌、产气肠杆菌。肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，置置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h。取出以上试管，在培养液中加入乙醚取出以上试管，在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡使吲哚萃取，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察）响结果观察）。如有吲哚存在，乙醚
10、层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用阴性反应，阳性用“”、阴性用、阴性用“”表示。表示。结果观察结果观察（五）柠檬酸盐试验原理原理有有些些细细菌菌能能够够利利用用柠柠檬檬酸酸钠钠作作为为碳碳源源，如如产产气气肠肠杆杆菌菌；而而另另一一些些细细菌菌则则不不能能利利用用柠柠檬檬酸酸盐盐，如如大大肠肠杆杆菌菌。细细菌菌在在分分解解柠柠檬檬酸酸盐盐后后，产产生生碱碱性性化化合合物物，使使培培养养基基的的pH升升高高，当当培培养养基基中中加加入入1%溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝指指示示剂剂时时，就就会会由由绿绿色色变变为为
11、深深蓝蓝色色。（溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝的的指指示示范范围围为为：pH小小于于6.0时时呈呈黄黄色色，pH在在6.07.6时为绿色，时为绿色，pH大于大于7.6时呈蓝色。）时呈蓝色。）材料材料菌种：同菌种：同VP试验试验培养基：柠檬酸盐培养基（固体斜面）培养基：柠檬酸盐培养基（固体斜面）步骤步骤1试管标记试管标记取装有柠檬酸盐培养基固体斜面的试管取装有柠檬酸盐培养基固体斜面的试管2支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。菌。2接种培养接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管斜面上做斜面上做斜面上做斜面上做“之之之之”字形划
12、线字形划线字形划线字形划线，置置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h。结果观察结果观察（六）硫化氢试验原理原理有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。硫化铅或硫化铁沉淀物。材料材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌菌种：大肠杆菌、变形杆菌培养基：培养基：H2S试验培养基（固体）试验培养基（固体）步骤步骤1试管标记试管标记:取装有取装有H2S试验试验固体培养基的试管固体培养基的试管2支，分别标
13、记大肠支，分别标记大肠杆菌、变形杆菌杆菌、变形杆菌。2接种培养接种培养:以无菌操作分别用以无菌操作分别用接种针接种针接种针接种针挑取少量菌苔到以上相应试挑取少量菌苔到以上相应试管做管做穿刺接种穿刺接种穿刺接种穿刺接种，置，置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h。结果观察结果观察（七）淀粉水解试验原理原理有些细菌可产生淀粉酶水解培养中的淀粉为糊精，或进一有些细菌可产生淀粉酶水解培养中的淀粉为糊精，或进一步水解为麦芽糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝。步水解为麦芽糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝。材料材料菌种：大肠杆菌、枯草杆菌菌种：大肠杆菌、枯草杆菌培养基：淀粉培养基（固体）培养基：淀粉培养基（固体）(pH
14、值值:7.2)配方配方:每升培养基含每升培养基含蛋白胨蛋白胨:10g牛肉膏牛肉膏:5gNaCl:5g可溶性淀粉可溶性淀粉:2g琼脂琼脂:20g（七）淀粉水解试验步骤步骤1培养皿标记培养皿标记取装有淀粉培养基（固体）的培养皿一只，在培养皿两侧分取装有淀粉培养基（固体）的培养皿一只，在培养皿两侧分别标记大肠杆菌、枯草杆菌。别标记大肠杆菌、枯草杆菌。2接种培养接种培养以无菌操作分别用接种环挑取少量菌苔到培养皿相应部位做以无菌操作分别用接种环挑取少量菌苔到培养皿相应部位做十字接种十字接种十字接种十字接种，置，置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h。结果观察结果观察取出平板，加上少量碘液，轻轻摇动，使
15、碘液铺满平板表面，观察菌落周围是否出现透明圈及圈的大小。六实验结果与分析六实验结果与分析1 配制培养基配制培养基糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基淀粉培养基淀粉培养基色色H2S试验培养基试验培养基柠檬酸盐培养柠檬酸盐培养每组配制一种培养基每组配制一种培养基,300mL.,300mL.实验内容及分工实验内容及分工,时间安排时间安排2 灌装试管灌装试管糖发酵培养基（葡萄糖）糖发酵培养基（葡萄糖）-水培养液水培养液糖发酵培养基（乳糖）糖发酵培养基（乳糖）-水培养液水培养液葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基-水培养液水培养液蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基-水培养液水培养液柠檬酸盐培养柠檬酸盐培养（固体斜面）（固体斜面）H2S试验培养基试验培养基（固体）（固体）淀粉培养基淀粉培养基每组每种培养基装3只试管.作好标记(培养基名称,组别,接种微生物,日期).淀粉培养基用三角瓶装好淀粉培养基用三角瓶装好,灭菌后倒平板灭菌后倒平板.3 灭菌灭菌(集体进行集体进行)4 摆斜面摆斜面,倒平板倒平板(分组进行分组进行)5 接种接种(分组进行分组进行,每组每组14支试管支试管,2个平板个平板)6 置置37培养箱培养培养箱培养7 实验结果观察实验结果观察:24-48h后后
