定量PCR分析的相对定量法

定量 PCRPCR分析的相对定量法预先研读科研文献，提出问题。拟用60Co-Y射线照射 HeLa 细胞，经 0,2,4,8,10Gy 不同吸收剂量照射 4 小时后，研究60Co-丫射线对 GRP78 mRN 表达水平的剂量影响关系。设计拟扩增 GRP78GRP78 以及 GAPDHGAPDH（内参基因）引物序列，稀释合成后引物，验证是否合格 能用，储存备用。上下引物可以考虑预混，储存备用。准备总 RNA 提取试剂盒，熟悉实验方法，即熟悉基本步骤与相应所用耗材，知道经该试剂盒方法提取后实际剩下的总RNA 体积数。6 瓶细胞，接种培养至第二天早晨。4 小时。准备所用耗材。先培养二瓶细胞，长满后消化后混合，细胞计数，分成编号。送去钴源室60Co-丫射线照射，无菌操作，放回培养按试剂盒程序提取各瓶细胞总 RNA 编号，测定并记录各管总 RNA 含量与体积数。当天反转 录成cDNA 并编号，测定总 cDNA 含量与体积数。预约定量 PCF 仪器使用时间。做 5X6X2=60 份定量 PCR 反应计划，因有 5 个剂量组，每一个剂量组做 6 次平行，2 个基因。考虑额外需要，故预混试剂拟 按 70 份反应计划去准备。做好 96 孔板中各孔排布图。配制除样品 cDNA 和引物外的预混液，按计划加入 96 孔板中各孔指定位置 内。再有规律地依 次加入规定量的 cDNA 样品，然后在排布图指定孔位置中加入指定量和指定种类的引物。核 实或做好加样记录。定量 PCR 仪器分析开机预热、设定定量 PCR 仪器基本参数、位置参数和循环参数等；再次混 匀 96 孔板中样品，将样品 96 孔板放入仪器中，检查后 运行 PCR 仪器。设计原始资料表格样式，记录各组实际扩增后所得GRP78 CT 值剂量Gy重复1CT 值。GAPDH CT 值重复2重复3重复4重复5重复重复重复2重复3重复4重复5重复616024810根据前面介绍的绝对定量法得到的标准曲线如下图，结合上表查找相应的基因含量数,转录如下表中，然后计算相应的平均数与标准差。1GRP78 基因拷贝数剂重量复Gy1GAPDH 基因拷贝数统计X重复2重重复复34重复5重复6重SD重复2重复3重复4重复5重复6统计X复1SD024810GRP78/GAPD 内参基因进行相对比校对，再对0 剂量组进行定基比校对，分析表制表如下:GRP78 基因含量 XGAPDHi 因含量 XGRP78/GAPDH均值二次校对剂量校对 SDSD0以左边数为 100%24810根据均值二次校对值和校对 SD 用 SPSS 软件做结果的 ANOVAANOVA 统计分析，检验各组之 间的差异有无统计学意义，然后用 excel 软件作柱状图，并在柱状图上标示出 SD 变化，以 及有无统计显著性差异的标识。将该 excel 柱状图结果转换成 PPTPPT 结论图，并给出图题、图例、实验方法主要内容以及 注释。转换成 JPG 文件，交给老师。2