第八章-酶工程（一）课件

酶 工 程（一）酶工程1概述2酶的命名和分类3酶的化学本质、来源和生产4酶催化反应机理及反应动力学5酶的固定化和固定化酶反应器6酶工程的应用7酶工程的研究进展一 酶和酶工程的概述（一）、酶的概念（二）、对酶的认识和研究历程（三）、酶工程的概念（一）、酶的概念 酶是生物催化剂，主要是蛋白质，也有核酸，能在比较温和的条件下高效率的起催化作用，使生物体内的各种物质处于不断的新陈代谢中。生物体内新陈代谢各种化学反应条件温和（37，近中性），速度快，有条不紊。（二）、对酶的认识和研究历程v人们对酶的认识起源于生产实践，人类几千年前，都开始制作发酵及食品。v1833 年，Pagon Persoz 从麦芽中得到一种能水解淀粉的物质淀粉酶。v1878 年，Khne 将这类生物催化剂统称为“酶”（Enzyme）v1887年，Buechner兄弟发现不含酵母细胞的酵母提取液也能使糖生成酒精，证实了发酵与细胞活力无关，并表明了酶能以溶解的、有活性的状态从破碎的细胞中分离出来。v1926 年，Sumner 从刀豆中提取脲酶，得到结晶，证明是蛋白质。后来，先后获得胃蛋白酶，胰蛋白酶的结晶v1969 年人工合成牛胰核糖核酸酶。v1983 年，发现核酸的催化功能1989 获诺贝尔奖（三）、酶工程的概念v酶工程：工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于其它目的的一门应用技术。广义地讲还包括酶的生产、分离和纯化。国际酶工程学会（1971年）定义：是研究和开发酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等的工程科学。按现代观点，酶工程主要包括以下内容酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用新颖酶的发现、研究和应用酶的固定化技术和固定化酶反应器基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究有机介质中酶的反应酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究抗体酶、核酸酶的研究模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究二 酶的命名和分类（一）、习惯命名法（二）、国际系统分类法（三）、国际系统命名法（四）、同工酶（五）、酶的活力和活力单位（一）、习惯命名惯用名 常依据酶所作用的底物和反应类型命名。原则：（1）根据作用底物：如淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶等。（2）根据反应性质：如水解酶、脱氢酶、转氨酶等。（3）二者结合：如乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶等。（4）再加上酶的来源、特性：如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶等。（二）、国际系统分类法根据反应性质分为六大类1、氧化还原酶类：催化氧化还原反应，涉及H 和电子的转移。如脱氢酶类。2、转移酶类：催化分子间功能基团的转移。如转氨酶类。3水解酶类：催化水解反应。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4裂合酶类：催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。如醛缩酶脱氨酶 脱羧酶5异构酶类：催化同分异构体的相互转变。6、合成酶：与ATP 分解相偶联，并由二种物质合成一种物质。如天冬酰胺合成酶 丙酮酸羧化酶 在每一大类酶中，又根据底物中被作用的基团或键的特点分为若干亚类，然后再把属于某一亚类、亚亚类的酶按顺序排好，这样把已知的酶分门别类地排成一个表，叫做酶表。v类 亚类 亚亚类 序号如 EC1.1.1.27 为乳酸：NAD+氧化还原酶 EC1.1.1.37 为苹果酸：NAD+氧化还原酶 EC1.1.1.1 为乙醇：NAD+氧化还原酶（三）、国际系统命名法要求确切表明底物的化学本质及酶的催化性质。原则如下：1 酶的系统命名有两部分构成：底物名称（底物1：底物2）反应名称如果底物2为水，可略去不写醇脱氢酶为醇：NAD+氧化还原酶L乳酸：NAD+氧化还原 酶。2 不管酶的催化反应是正反应还是逆反应，都用同一个名称。当只有一个方向的反应能够被证实，或只有一个方向的反应有生化重要性时，自然以此方向为命名。NAD+和NADH相互转化的所有反应中（DH2+NAD+D+NADH+H+）都命名为：DH2：NAD+氧化还原酶v同工酶，指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它是研究细胞分化及形态遗传的分子学基础中的重要研究内容。v如超氧化物歧化酶（SOD）可以分为三大类，如CuZn-SOD,Mn-SOD和Fe-SODv另外，乳酸脱氢酶（LDH）也有5种同工酶，催化同一种反应v同工酶的命名，在系统或习惯命名中，都是一样的。（五）、酶的活力和活力单位酶的活力：指酶催化特定底物转化成产物的速率。酶的活力常常是制订酶制剂价格的最重要的参考指标影响酶的活力因素，包括环境条件、底物性质、酶本身因素等因素酶活力单位：指单位时间、单位质量酶蛋白所催化的底物反应或产物生成的物质的量（或质量）单位质量生物催化剂三、酶化学本质、来源和生产（一）酶的化学本质（二）酶的来源和生产（一）酶的化学本质除了核酸酶之外，酶都是具有催化功能的蛋白质。1 蛋白质的性质2、酶的化学组成1 按组成成分（1）单纯酶：其活性仅仅取决于蛋白质结构，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶。（2）结合酶：只有结合非蛋白组分后（辅助因子）后才表现出活性 全酶=酶蛋白辅助因子2、按酶分子大小（1）单体酶：一般有有1条多肽链组成，几乎都是水解E，Mr=1300035000，不含四级结构，如溶解酶，胰蛋白酶等（2）寡聚酶：由几个亚基通过非共价键结合，Mr=35000数百万，具有四级结构，如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脱氢酶（3）多酶复合体：由几种酶嵌合而成的复合体，靠共价键连接 Mr几百万。（4）核酶 少数RNA 具有自我拼接加工的催化活性。（二）酶的来源和生产1 酶的来源1）直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯不足：生产周期长，来源有限，还要受一些自然条件的限制。2）化学合成方法不足：一般只适用于短肽的生产3）工业微生物发酵，即通过液体深层发酵或固态发酵，是工业上酶的主要来源。其优点如下：微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全微生物繁殖快，生产周期长微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶的菌株。微生物细胞产生的酶分类结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达，诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是该酶所催化反应的底物或产物。一般而言，野生型微生物需要经过遗传改造后，才能变为高产酶的菌株。其方法包括物理诱变育种化学诱变育种基因工程构建优良菌种的条件繁殖快、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最好能产生分泌到胞外的酶，产生的酶容易分离纯化菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易受噬菌体的感染侵袭易于培养，能够利用廉价的原料进行酶的生产，并且发酵周期短。菌种不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，不产生有毒物质和其他生理活性物质不产或尽量少产蛋白酶一些常用微生物及它们所产生的酶2.酶的生产影响酶生产的主要因素1）培养基设计：设计好供微生物生长、繁殖、代谢和合成代谢产物的营养物质和原料。其中诱导酶的生产，需要加入诱导剂2）发酵方式的选择：固体发酵：又称为表面培养或曲式培养，以麸皮、米糠等为基本原料，加入适量的无机盐和水作为培养基进行产酶微生物菌种培养的一种培养技术。特点：设备简单、便于推广，特别适合于霉菌，缺点:发酵条件不易控制，物料利用不完全，劳动强度大，容易染菌等。液体深层发酵：又称浸没式培养，利用液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌式通气培养方式，发酵过程需要一定的设备和技术条件，动力消耗也较大，但是原料的利用率和酶的产量都较高。目前，工业上主要采用液体深层发酵技术生产酶，但是在酒曲培养、食品工业及一些用于饲料添加剂的酶生产中，仍在应用固态发酵技术。3）发酵条件控制营养条件环境条件，注意溶氧浓度、温度、pH值特别注意剪气力对蛋白质的影响，因为在高剪切力下，蛋白质容易失活。注意发酵的泡沫，因为蛋白质是表面活性剂，大量的蛋白质积累在发酵液中使得在鼓泡条件下很容易形成泡沫，影响发酵正常操作。因此应该考虑除泡装置，并添加消泡剂。3.酶的分离和提纯1）酶的用途及对酶纯度的要求：科学研究需要最高的纯度，必要时需要结晶医用需要很高的纯度，避免不良反应食品工业在安全性的基础上，纯度可低一些工业用在达到一定酶活性的基础上，对纯度要求不高2）酶的分离提纯在酶生产中投入成本很大蛋白酶的浓度很低，而分离提纯的费用往往随着产物初始浓度的下降呈指数式上升。细胞破碎液或发酵液存在大量与目标酶蛋白性质类似、分子量接近。酶对环境条件敏感，环境中的蛋白酶容易作用于目标酶，使其失活。3）在实现目的的情况，可直接用整个细胞作为生物催化剂细胞内目标酶的活性很高，可以满足工业过程对酶活的要求胞内酶的催化作用必须依赖于辅酶，可以利用细胞内的辅酶再生系统所需要的生物转化过程需要细胞内几种酶的共同参与4）酶的分离提纯的步骤在此过程中，保持酶的活性是最为关键的。因此，全部操作必须在低温下进行，一般在05间，还要防止重金属失活、防止SH被氧化，不能过度搅拌等细胞破碎的方法：动物细胞比较容易破碎，通过一般的研磨器、匀浆器、捣碎机等可达到目的细菌细胞壁较厚，破碎需要用超声波、细菌磨、溶菌酶、某些化学溶剂（如甲苯、去氧胆酸纳）或冻融等处理破碎后的分离方法：过滤、沉降等酶的分离纯化盐析法：eg（NH4）SO4、Nacl，Na2SO4、使E析出之后需超盐处有机溶剂沉淀法：用3060%的乙醇、丙酮、异丙醇等，保持低温-10-15等电沉淀法：调节到PI使之絮聚、沉降。层析法：亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤曾析，吸附层析等v酶的保存：低温、干燥、避光、避氧。四、酶催化反应机理及反应动力学（一）酶催化反应的特点（二）酶催化反应的机理（三）酶催化反应的速率理论（四）酶促反应动力学（一）酶催化反应的特点1.反应条件温和：常温、常压、接近中性的pH值2.催化效率高。以分子比表示，酶催化比非催化的反应速度高1081020倍，比其他催化反应高1071013。3.举例1：H2O2H2OO2 （）Fe2+催化 10-5mol/s （）H2O2E催化105mol/sE的催化能力高1010倍 举例2：已知催化反应最快的是碳酸酐酶。CO2H2O H2CO3 每个E分子每秒可催化6105个CO2分子与水碱H2CO3比非酶催化快107倍。3.酶的作用专一性。通常把酶作用的物质称为该酶的底物（substrate)。一种酶只作用于一种或一类底物。反应专一性（键专一性）：这些酶的专一性较低，能够催化具有相同化学键或基团的底物进行某种类型的反应。如酯酶底物专一性：只能催化特定底物发生特定的反应。如脲酶只能催化尿素，而且只能是水解反应立体化学专一性：表现为对底物的构象有特殊的要求。如L乳酸脱氢酶只能催化L-乳酸的氧化，而对D-乳酸则不起作用。4.酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。辅助因子分为辅酶和辅基辅酶：与酶蛋白松弛结合，可以通过透析或其他方法将其从全酶中除去，如NADH，ATP及各种维生素辅基：以共价键和酶蛋白质结合，不易透析除去，如Ca2+、Co2+、Zn2+、Mg2+等金属离子5.酶易失活。凡使蛋白质变性的因素都能使酶破坏而完全失去活性6.酶活力的调节控制。在各种水平上进行，酶水平的调控方式包括：抑制调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素调控等。（二）酶的催化反应机理1 酶的活性中心指酶分子中直接和底物结合，并和酶的催化作用直接有关的部位。（1）结合基团：与S结合的基团。（2）催化基团：直接参与催化反应的基团。酶的活性部位，不仅决定酶的专一性，同时对E的催化性质起决定作用。活性部位的基团都是必需基团，必需基团还包括活性部位以外的，对维持空间构象必需的基团。2 关于酶催化的专一性作用机制假说（1）锁钥匙学说：1890年Fisher提出。该学说认为酶的天然构象是刚性的，如果底物分子结构上存在着微小的差别，就不能契入酶分子中，从而不能被酶催化。（2）诱导契合假说:Koshland提出当酶分子与底物接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发