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1、第七章第七章 现代生物技术与环境污染治理现代生物技术与环境污染治理生物技术（Biotechnology）也称生物工程（Bioengineering）以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，发展新产品或达到某种目的的一种技术体系。基因工程、细胞工程、酶工程、发基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程酵工程、蛋白质工程生物体生物体传统发酵所利用的微生物，动植物细胞或细胞中的酶生物原料生物原料淀粉，糖蜜，纤维素等有机物；一些无机化学品；无机矿石产品产品医药，食品，化工，能源，金属产品和各种动植物的优良品种等目的目的包括疾病
2、的预防、诊断和治疗、环境污染的检测和治理 现代生物技术现代生物技术以20世纪70年代末发展起来的，以现代生物学研究成果为基础，以基因工程技术为核心的一系列技术。以70年代DNA重组技术的建立为标志二十世纪五十年代，DNA双螺旋结构学说发现二十世纪七十年代，重组DNA技术，单克隆抗体技术，第一个基因工程药物脱颖而出二十世纪八十年代，第一株转基因植物，第一例转基因动物横空出世二十世纪九十年代，克隆动物和人类基因组计划1953年，美国生物学家，沃森，英国物理学家，克里克，发现了DNA由两条螺旋多核苷酸链组成。为人类揭开生命的秘密奠定了基础。基因是带有遗传效应的DNA片段基因工程-重组DNA技术：利用
3、人工手段去改造生物的遗传性状，按照人们的预想重新设计生命的过程，人工创造新生物并给予生物以新功能的过程单克隆抗体技术：1975年，英国科学家米尔斯坦利用细胞融合技术将一个B型淋巴细胞，和一个骨髓瘤细胞融合在一起形成一个杂交瘤细胞，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体的抗体叫做单克隆抗体抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂
4、增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。基本原理其原理是:B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。第一个基因工程药物：1977年11月美国人工方法化学合成了人生长激素释放抑制素基因，具有工程菌的功能。将其置于微生物发酵罐里，繁殖，其代谢产物含有人生长激素释放抑制素.（1B干扰素）第一株转基因植物第一株转基因植物：1982年美国和比利时的学者
5、，分别把细菌中抗碘那霉素基因转入向日葵，烟草和胡萝卜的细胞中，使这些植物的抗药性提高八倍多。第一例转基因动物第一例转基因动物：1980年美国华盛顿大学和宾西法尼亚大学的学者，把大鼠的生长激素基因与小鼠的一段基因拼接在一起组成一个重组体，把这个重组体注射到小鼠的受精卵里，再把受精卵移植到借腹怀胎的雌鼠体内，生下的小鼠其生长速度比普通小鼠的平均生长速度快50%。克隆动物技术：1997年2月27日，自然杂志报道了一项震惊世界的科学创举，英国胚胎学家维尔穆特博士领导的研究小组，应用克隆技术，成功地复制了一头雌性芬兰塞特绵羊多莉。证明一个已经完全分化成熟的体细胞，还能像胚胎细胞一样，其细胞所具有的遗传信
6、息也能指导产生新的个体。2003年2月14日死亡人类基因组计划：1990年开始启动，计划15年内完成人类全部基因组30亿个碱基对的排列顺序的测定和图谱分析。即把人体内十万个基因所在的位置确定下来，把基因分离出来，研究其功能，认识基因和疾病的关系。2005年完成 一般把找到的基因称为靶基因。基因治疗就是对相关的基因进行抑制或调整。所有的药物开发，是先在靶基因上实验的。因此有了基因，就可以制造基因工程诊断试剂，基因工程治疗药物，甚至形成治疗这种疾病的药物产业。（1）基因工程（重组）基因工程（重组DNA技术技术)（2）细胞工程）细胞工程（3）发酵工程）发酵工程（4）酶工程）酶工程（5）蛋白质工程）蛋
7、白质工程（6）生态工程技术生态工程技术（1）基因工程（又叫做）基因工程（又叫做基因拼接技基因拼接技术术或或DNA重重组组技技术术)用人工方法把不同生物的基因分离出来，在体外进行剪切，拼接，重组在一起，然后把重组体放回宿主细胞内繁殖，最终获得基因产物。即用人工的手段改造生物的遗传性状，获得基因产物。基本步骤：基本步骤：目的基因的分离基因重组转化筛选和检测目的基因的表达功能验证基因操作的工具基因操作的工具基因的剪刀（分子手术刀）限制性核酸内切酶（限制酶）基因的针线（分子缝合针）DNA连接酶基因的运输工具（分子运输车）运载体(1)限制酶限制酶分布：主要在原核生物中作用特点:专一性，识别特定核苷酸序列
8、，切割特定切点。结果：产生黏性未端和平末端举例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶限制酶的识别特点限制酶的识别特点以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排上碱基呈反向对称，重复排列列 如：如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC黏性未端和平末端黏性未端和平末端(2)DNA连接酶连接酶连接的部位：磷酸和脱氧核糖之间的键：磷酸二酯键（梯子的扶手）结果：两个相同的未端的连接。举例：EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶(3)运载体运载体作用：将外源基因送入受体细胞。具备的条件：能在宿主细胞内复制并稳定地保存 具有多个限制酶切点 具有某些标记基因 对受体细胞无
9、害举例：质粒、噬菌体 和动植物病毒工具酶工具酶载体载体如质粒、噬菌体、病毒。能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶获取目的基因方法：获取目的基因方法：1.从基因文库中获取目的基因。2.利用PCR技术合成DNA3.mRNA差异显示法获得目的基因（反转录）模板DNA95PCR原理PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR
10、的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的过程的过程（1）以DNA片段作模板，在90高温下，分开成为单链DNA。（2）以DNA小段寡聚核苷酸做引物，在50左右的温度下，找到可以配对的正链和负链，形成互补结合（3）在70左右的高温下，合成一条与模板DNA单链（正链或负链）互补结合的DNA新链。（4）以上三个步骤周而复始，即反
11、应体系的温度从90-50-70，目的基因的量不断增加，反应体系中经历：变性淬火合成重复。结果：目的基因的量成指数形式扩增（2n)基因表达载体的构建基因表达载体的构建表达载体需由哪几部分组成表达载体需由哪几部分组成复制原点复制原点启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子标记基因标记基因目的基因目的基因原核细胞原核细胞物质的鉴定与检测核酸：PCR扩增、电泳、测序、杂交（Southern,DNA芯片等）蛋白质：ELISA、Westhern,蛋白芯片等其他化学物质：LC-MS,GC-MS等DNA琼脂糖电泳DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，
12、在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。色谱法是一种分离方法它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结
13、构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法GasChromatogaphy，简称简称GC适合分离分析适合分离分析易汽化易汽化（在（在-190-500范围内有范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）的蒸气压的）稳定、不易分解、不易稳定、不易分解、不易反应反应的样品，特别适合用于的样品，特别适合用于同系物、同分异构体同系物、同分异构体的分离。的分离。以液体为流动相的色谱法以液体为流动相的色谱法LiquidChromatogaphy，简称简称LC适合分离分析
14、高沸点、热不稳定、离子型的样品。适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。色谱定性分析 纯物对照定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标。色谱定量分析 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有丹参药材有效成分的HPLC图谱质谱，即质量的谱图，物质的分子在高真空下，经物理作用或化学反应等途径形成带电粒子，某些带电粒子可进一步断裂。每一离子的质量与所带电荷的比称为质荷比(m/z,曾用m/e)。不同质荷比的离子经质量分离器一一分离后，由检测器测定每一离子的质荷比及相对强度，由此得出的谱图称为质谱。所有的质量分析器检测的都
15、是离子的质量数，是质荷比m/z，是气相态的离子，都必须在真空状态下操作质谱原理38GC/LC/DirectProbeInlet离子源EI/CI离子阱/四极杆电子倍增管质谱法（MassSpectrography,MS）是通过对样品离子的质量和强度进行定性、定量和结构分析的方法，是直接测量物质微粒的技术，质谱图提供化合物的“指纹”特性；应用于1、对物质组成、结构进行定性检测2、准确确定物质的相对分子量化合物分子在高真空条件下气化成气态分子，经一定能量的电子流轰击后失去一个电子成为带正电荷的离子成为离子分子，并进一步碎裂为碎片离子（带正电）。在电场与磁场的综合作用下按照各自的质核比的大小一次被收集并
16、记录成谱，即质谱，用以研究分子结构的方法成为质谱法应用：1、同位素及其丰度的测定,2、化合物结构的鉴定用样量（10-910-6）将未知物的质谱与已报道过的质谱相比较就可鉴定未知物。目前有标准质谱集合质谱图计算机检索16SrDNA方法鉴定细菌种属细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA基因由保守区和可变区组成在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子以微流控芯片为基础的生命科学及相关环境分析研究。用于病原微生物检测的微流控芯片系统的研究基于微流体芯片的水质检测系统研究蓝绿藻爆发预警饮用水城市用水在线监测生物气溶胶的快速分析蠕蠕动循循环泵微生物裂解室微生物裂解室检测系系统所用的芯片将是根据不同所用的芯片将是根据不同
