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1、12021/7/19 星期一基因工程基因工程背景：背景：家蚕能够吐出蚕家蚕能够吐出蚕丝为人类利用。但繁殖慢，丝为人类利用。但繁殖慢，产量低。产量低。能否让大肠杆菌也能吐蚕丝呢？能否让大肠杆菌也能吐蚕丝呢？大肠杆菌繁殖很快，但不大肠杆菌繁殖很快，但不会产丝。会产丝。22021/7/19 星期一用人工方法，把甲生物的某个基因提取用人工方法，把甲生物的某个基因提取出来，在体出来，在体外进行外进行切割、拼接和重组切割、拼接和重组，然后将其，然后将其导入导入乙生物的乙生物的细胞内进行大量细胞内进行大量复制复制，并进行，并进行表达表达，从而定向地改，从而定向地改变乙生物的遗传性状，或获得人类所需要的基因变
2、乙生物的遗传性状，或获得人类所需要的基因产产物物（蛋白质、多肽、酶）。（蛋白质、多肽、酶）。剪切拼接导入剪切拼接导入甲甲生生物物取出所需基因取出所需基因生物生物新类型新类型表达表达新的新的生物生物产品产品乙乙生生物物32021/7/19 星期一基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：行基因操作最少需要以下三种工具：、基因的手术刀、基因的手术刀、基因的针线、基因的针线3 3、基因的运输工具、基因的运输工具42021/7/19 星期一主要在主要在原
3、核生物原核生物中。中。特异性特异性。即一种限制性内切酶只能识。即一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将的切割点上将DNA分子切断分子切断（使连接使连接脱氧核苷酸的脱氧核苷酸的磷酸二酯键磷酸二酯键断裂）断裂）。已发现数千种已发现数千种种类种类:来源来源:特点特点:、基因的剪刀基因的剪刀限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶52021/7/19 星期一 例如：大肠杆菌的一种限制酶能识别例如：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在序列，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶62021/7/19 星期一G A A T T CC T
4、T A A G55553333粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端限制性限制性限制性限制性内切酶内切酶内切酶内切酶C T T A AG5533A A T T CG3355被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们几个伸出的核苷酸，他们两个两个之间正好之间正好反向反向互互补配对，这样的切口叫粘性末端。补配对，这样的切口叫粘性末端。被同一种限被同一种限制酶切断的几个制酶切断的几个DNA就具有相同的粘性末端，就具有相同的粘性末端，能够通过互补进行配对。能够通过互补进行配对。T G C AA C G T55333355不同的限制酶所形不同的限制酶所形成
5、的粘性末端不同成的粘性末端不同A C GT5533G C AT3355另一种另一种另一种另一种限制酶限制酶限制酶限制酶、基因的针线、基因的针线作用：作用：将粘性末端碱基互补的两个将粘性末端碱基互补的两个DNA片段片段连接起来，使之成为一个完整的连接起来，使之成为一个完整的DNA分子分子（使两个（使两个DNA片段通过片段通过磷酸二酯磷酸二酯键键连接成一个连接成一个DNA分子）分子）。DNA连接酶连接酶92021/7/19 星期一C T T A AG A A T T CG连接酶连接酶连接酶连接酶3 3、基因的运输、基因的运输 工具工具基因载体的条件：基因载体的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
6、。能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。具有多个限制酶切点（具有多个限制酶切点（每种限制酶切点只每种限制酶切点只有一个有一个），以便与外源基因连接。），以便与外源基因连接。具有标记基因，便于进行筛选。具有标记基因，便于进行筛选。载体载体要把甲生物取出的基因送到乙生物的细胞中去，要把甲生物取出的基因送到乙生物的细胞中去，需要运输基因的载体。需要运输基因的载体。112021/7/19 星期一最常用的基因载体是细菌细胞质的最常用的基因载体是细菌细胞质的质粒质粒（核区）（核区）质粒（细胞质质粒（细胞质DNA）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌质粒质粒质粒质粒能能能能自主复制自主复制自主复制自主复制的的的的双
7、链环状双链环状双链环状双链环状DNADNA分子，分子，分子，分子，存在于细菌存在于细菌存在于细菌存在于细菌核区核区核区核区以外，以外，以外，以外，带有少量基因，其中带有少量基因，其中带有少量基因，其中带有少量基因，其中常含常含有有有有抗生素抗性基因（如抗生素抗性基因（如抗生素抗性基因（如抗生素抗性基因（如四环素的抗性基因）四环素的抗性基因）四环素的抗性基因）四环素的抗性基因），使细菌有抗药性，一个细菌中有，使细菌有抗药性，一个细菌中有，使细菌有抗药性，一个细菌中有，使细菌有抗药性，一个细菌中有多个质粒。多个质粒。多个质粒。多个质粒。122021/7/19 星期一最常用的基因载体是细菌细胞质的最
8、常用的基因载体是细菌细胞质的质粒质粒（核区）（核区）质粒（细胞质质粒（细胞质DNA）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌质粒与宿主细胞的关系：质粒与宿主细胞的关系：质粒与宿主细胞的关系：质粒与宿主细胞的关系：1 1、质粒的存在对宿主细胞、质粒的存在对宿主细胞、质粒的存在对宿主细胞、质粒的存在对宿主细胞无影响无影响无影响无影响。2 2、质粒的复制、质粒的复制、质粒的复制、质粒的复制只能只能只能只能在宿主细胞内完成。在宿主细胞内完成。在宿主细胞内完成。在宿主细胞内完成。132021/7/19 星期一抗生素抗性基因（标抗生素抗性基因（标记基因）记基因）（细胞质（细胞质DNA）（核区）（核区）质粒质粒(细
9、胞质细胞质DNA)大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌控制质粒控制质粒DNA转转移的基因移的基因142021/7/19 星期一4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞1 1、获得目的基因、获得目的基因2、形成重组、形成重组DNA分子分子3 3、将、将重组重组DNA分子分子导入受体细胞导入受体细胞5 5、目的基因的表达、目的基因的表达第二节基因工程的原理和技术第二节基因工程的原理和技术u基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟152021/7/19 星期一逆转录法：逆转录法：信使信使RNARNA逆转录酶逆转录酶DNADNA单链单链合成合成DNADNA双链双链(基因基因)直接
10、合成法：直接合成法：组成蛋白质的组成蛋白质的氨基酸序列氨基酸序列推测推测信使信使RNARNA核苷酸序列核苷酸序列推测推测基因单核基因单核苷酸序列苷酸序列合成合成基因双链基因双链、获得目的基因、获得目的基因（1 1）化学合成法）化学合成法（目的基因的序列（目的基因的序列巳知巳知）162021/7/19 星期一人工合成人工合成(基因比较小基因比较小)DNA合成仪合成仪172021/7/19 星期一（2 2）用聚合酶链式反应）用聚合酶链式反应(PCR)(PCR)扩增目的基因扩增目的基因182021/7/19 星期一1234522557294时间（min）温度（）PCR反应适温延伸3高温变性1低温退火
11、2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍192021/7/19 星期一202021/7/19 星期一（3 3）从基因文库中分离：）从基因文库中分离：目的基因的脱氧核苷酸序列是目的基因的脱氧核苷酸序列是未知的未知的，可以从基因文库中找到目的基因（酶切）。可以从基因文库中找到目的基因（酶切）。（2 2）用聚合酶链式反应）用聚合酶链式反应(PCR)(PCR)扩增目的基因扩增目的基因212021/7/19 星期一基因组文库的构建模式图基因组文库的构建模式图通过对通过对受体菌受体菌的培养而的培养而储存基因储存基因222
12、021/7/19 星期一2、形成重组、形成重组DNA分子分子用用相同相同的限制性核的限制性核酸内切酶分别切割目的酸内切酶分别切割目的基因和载体；基因和载体；目的基因与载体的结合过程目的基因与载体的结合过程基因重组基因重组用用DNA连接酶将目连接酶将目的基因和载体连接在一的基因和载体连接在一起，形成重组起，形成重组DNA分子分子（或重组质粒）。（或重组质粒）。232021/7/19 星期一3、将重组、将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞导入导入扩增扩增将重组将重组DNA分子导入受体细胞并使之扩增。分子导入受体细胞并使之扩增。a a、为使、为使重组的质粒更容易进入大肠杆菌重组的质粒更容易进
13、入大肠杆菌，用，用氯化钙氯化钙处处理大肠杆菌，理大肠杆菌，增加增加大肠杆菌大肠杆菌细胞壁的通透性细胞壁的通透性。a.如要获得目的基因的如要获得目的基因的表达产物，表达产物，通常以大肠杆菌等无害易得的细通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。菌为受体。b.如要如要改良某种生物的性状改良某种生物的性状时，时，要以改良的生物细胞为受体。要以改良的生物细胞为受体。问题：谁是受体？问题：谁是受体？242021/7/19 星期一3、将重组、将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞将重组将重组DNA分子导入受体细胞并使之扩增。分子导入受体细胞并使之扩增。1 1、受体为植物细胞：农杆菌介导法、受体为植物细胞
14、：农杆菌介导法 基因枪法基因枪法 花粉花粉管道法管道法 b.如要如要改良某种生物的性状改良某种生物的性状时，要以改良的生物细胞为时，要以改良的生物细胞为受体。受体。2 2、受体为动物细胞：基因枪法、受体为动物细胞：基因枪法 显微注射法显微注射法252021/7/19 星期一1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法262021/7/19 星期一（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点：易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力物没有感染能力原理：原理：Ti
15、Ti质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。272021/7/19 星期一转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入 植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌282021/7/19 星期一 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，
16、使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物292021/7/19 星期一（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基因）（含目的基因），使目的基因借助花，使目的基因借助花粉管通道进入受体细粉管通道进入受体细胞。胞。适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物302021/7/19 星期一胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊312021/7/19 星期一2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提（将基因表达载体提纯，纯，用显微仪注射到用显微仪注射到 受精卵受精卵中）中）322021/7/19 星期一（2 2）操作程序）操作程序:提纯
