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1、上海市食品药品检验所上海市食品药品检验所2021年年5月月27徐徐伟伟东东微生物鉴定技术在药品检验微生物鉴定技术在药品检验和监管中的应用和监管中的应用微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一一、背景介绍一、背景介绍v在在1993-1998年间，美国年间，美国FDA报告的由微生物污染引起的召报告的由微生物污染引起的召回案件到达回案件到达1370件，占所有产品召回案件的件，占所
2、有产品召回案件的36%v我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。v药品平安管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢药品平安管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，导致药品受到等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，导致药品受到微生物污染微生物污染v我国各大城市不断承办国际大型体育赛事
3、和国际会议尤其是我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议尤其是2021年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药品年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药品的监督管理水平的要求。的监督管理水平的要求。对微生物分类水平较低，只能鉴定对微生物分类水平较低，只能鉴定到到“属，鉴定微生物种类有限属，鉴定微生物种类有限传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限分子方法分子方法v分子生物学技术研究的是微分子生物学技术研究的是微生物生物DNA序列信息，常用序列信息，常用于细菌分类的于细菌分类的16SrDNA也有也有1500个碱基，每个碱个碱基，每个碱基位置由基位置由ATGC四种核苷
4、酸四种核苷酸中的一种组成，多样性可达中的一种组成，多样性可达种可能约种可能约10900。v新版的新版的?伯杰氏系统细菌学伯杰氏系统细菌学手册手册?微生物微生物DNA变异信息变异信息为主为主传统方法传统方法v人类的土壤微生物已到达人类的土壤微生物已到达10万种万种v现在常用的微生物鉴定用生现在常用的微生物鉴定用生化反响只有化反响只有20多种，实际多种，实际经过研究形成一致标准的、经过研究形成一致标准的、有意义的生化鉴定结果仅有意义的生化鉴定结果仅2000多种。多种。v微生物生化鉴定金标准的微生物生化鉴定金标准的API鉴定系统鉴定系统仅能鉴定仅能鉴定550种细菌种细菌v通过碳源利用进行微生物鉴通过
5、碳源利用进行微生物鉴定的定的Biolog系统也仅能鉴系统也仅能鉴定定2000种微生物种微生物微生物变异能力强，生化反响准确微生物变异能力强，生化反响准确度不高，错检漏检现象普遍度不高，错检漏检现象普遍传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限v生化反响鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的生化反响鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同“属属微生物的酶系统根本相同，可以到达鉴定的目的微微生物的酶系统根本相同，可以到达鉴定的目的微生物
6、生物DNA突变能力强，如果这些突变点涉及到微生突变能力强，如果这些突变点涉及到微生物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷，物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷，导致鉴定失败导致鉴定失败v在现行国家标准中，只有血浆凝固酶阳性反响才会在现行国家标准中，只有血浆凝固酶阳性反响才会被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反响的微生物被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反响的微生物那么被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关那么被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关注的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金注的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金黄色葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄黄色
7、葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、球菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、社区食物中毒的重要污染源。社区食物中毒的重要污染源。不能对微生物污染进行准确溯源分析不能对微生物污染进行准确溯源分析传统微生物鉴定方法的局限传统微生物鉴定方法的局限v在进化过程中生物在进化过程中生物DNA分子会形成大量分子会形成大量DNA多态性多态性区域和非编码区域和非编码DNA序列。序列。不会造成生物种属归类争议不会造成生物种属归类争议也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析通过生化
8、鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析DNA位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是微生物种内差异的来源微生物种内差异的来源v如常用于真菌种类鉴定的如常用于真菌种类鉴定的ITS基因基因vITS片段能保持相对稳定的变异频率片段能保持相对稳定的变异频率v亲缘关系非常接近的亲缘关系非常接近的2个种都能在个种都能在ITS序列上表现出序列上表现出差异，显示最近的进化特征差异，显示最近的进化特征微生物鉴定技术平台的建设微生物鉴定技术平台的建设二二样品微生物的鉴定及同源性分析样品
9、微生物的鉴定及同源性分析三三微生物实验室能力建设微生物实验室能力建设微生物新技术的应用微生物新技术的应用四四微生物污染监管方式的思考微生物污染监管方式的思考五五背景介绍背景介绍一一2.1技术手段技术手段2.2方法比较方法比较2.1技术手段技术手段2.2方法比较方法比较革兰氏染色镜鉴革兰氏染色镜鉴按照标准进行按照标准进行传统的生化反响鉴定传统的生化反响鉴定API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪ATBExpression全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪（VITEK2）微生物鉴定手段微生物鉴定手段MiniVIDAS筛选系统筛选系统免疫凝集免疫凝集/免疫沉淀
10、实验免疫沉淀实验微生物检测手段微生物检测手段荧光定量荧光定量PCR(BAX)色谱、光谱分析技术色谱、光谱分析技术分子生物分子生物学技术学技术传统筛选方法传统筛选方法2.1技术手段技术手段GenBankGenBankPCR基因分型基因分型分子杂交分子杂交阳性菌分子水平上的鉴定阳性菌分子水平上的鉴定12341.形态学鉴定形态学鉴定3.核糖体水平上核糖体水平上的鉴定的鉴定APIVITEK16SrDNA序列分析序列分析分子杂交分子杂交DupontRiboPrinter2.生化鉴定生化鉴定傅里叶红外光谱傅里叶红外光谱Rep-PCR(DiversiLab)4.全基因组水平上全基因组水平上的鉴定的鉴定5.脉
11、冲场电泳技术脉冲场电泳技术(PFGE),多位点序多位点序列分析列分析(MLST),多多位点重复串联序列位点重复串联序列分析分析(MLVA),随机扩随机扩增多态性分析技术增多态性分析技术RAPD)API试剂条试剂条菌鉴定国际金标准菌鉴定国际金标准无需无需专专用用仪仪器，器，标标准化手工方法完成准化手工方法完成细细菌的生化菌的生化鉴鉴定，定，为为低本低本钱钱替代替代传统传统手工手工细细菌生化菌生化鉴鉴定的最正确定的最正确产产品。品。特点：特点：完整的完整的鉴鉴定定谱谱：15种种试试条，可条，可鉴鉴定的定的细细菌多于菌多于550种种简单简单方便：方便：标标准化方法，本准化方法，本钱钱低廉，判低廉，判
12、读结读结果果简单简单快速快速结结果：果：4-24小小时时。半自动细菌鉴定仪半自动细菌鉴定仪ATBExpression检测工程：可鉴定由环境、原料及制成品别离出的菌检测工程：可鉴定由环境、原料及制成品别离出的菌种和药敏试验包括：肠杆菌、非发酵种和药敏试验包括：肠杆菌、非发酵G-杆菌、杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌。可鉴定葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌。可鉴定770种细菌和分析近种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。种抗生素药敏实验。v原理：鉴定试条包含风干底物的反响孔，经标准浊原理：鉴定试条包含风干底物的反响孔，经标准浊度的菌液活化，于指定温度培养度的菌液活化，于指定温度培养4小时小时/
13、24小时后即小时后即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库，得出生化试剂条数据库，得出生化/同化结果和药敏试验结同化结果和药敏试验结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比较，以客观的较，以客观的2个参数鉴定百分率及个参数鉴定百分率及T-值计算值计算鉴定结果鉴定结果v特点：特点：v速度快捷速度快捷ATBExpression提供自动化接种，阅提供自动化接种，阅读及分析试条结果。读及分析试条结果。v准确可靠的结果准确可靠的结果ID32及快速及快速ID32试条由金牌试条由金牌标准标准API试
14、条改进而成，配合自动化概念，结合成试条改进而成，配合自动化概念，结合成完整的细菌鉴定系统完整的细菌鉴定系统全自动细菌鉴定仪全自动细菌鉴定仪VITEK2检测工程：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计检测工程：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比方革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性了不同的鉴定卡片，比方革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。可鉴定菌卡，酵母菌卡等。可鉴定405种细菌，种细菌，70多种药物多种药物约约50多种药物组合的药敏卡。多种药物组合的药敏卡。v原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用的生化反响。仪器把的生
15、化反响。仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反个对细菌鉴定必需的生化反响培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色响培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色反响进行判断，利用数值法进行判定。反响进行判断，利用数值法进行判定。v特点：特点：v快速：鉴定结果平均只需快速：鉴定结果平均只需4-6小时。对与快速生长细小时。对与快速生长细菌菌(大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等等)鉴定可提前到鉴定可提前到2小时。小时。v操作简便：全部操作自动化，简单而方便操作简便：全部操作自动化，简单而方便v资料处理：资料处理：bioLIAISON软件集中管理实验室
16、资料软件集中管理实验室资料v获得获得AOAC国际认证：保证提供的微生物鉴定结果国际认证：保证提供的微生物鉴定结果是公认的是公认的全自动荧光免疫分析仪全自动荧光免疫分析仪(mini-VIDAS)检测检测工程：食品及工程：食品及环环境中最常境中最常见见致病性致病性细细菌李斯特菌菌李斯特菌属、属、单单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠肠杆菌杆菌O157、沙沙门门氏菌属、葡萄球菌氏菌属、葡萄球菌肠肠毒素毒素检测检测的快速的快速筛检筛检。v原理：原理：以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光最后测蓝色荧光ELFA。包被针上有抗体包被，所。包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。v特点：特点：v结果准确：对每个标本做两次免疫反响，保证结果的结果准确：对每个标本做两次免疫反响，保证结果的可靠。灵敏度比可见光方法高出可靠。灵敏度比可见光方法高出1000倍。已获得美倍。已获得美国国FDA、日本厚生省、日本厚生省、AOAC、USDA、中国进出口、中国进出口商品检验局等政府
