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1、基因芯片技术及临床应用基因芯片技术及临床应用府伟灵府伟灵西南医院检验科西南医院检验科一一.概述概述随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。动植物、微生物基因组序列得到测定。在在GenBank数据库中已含有数据库中已含有300万个序列，总万个序列，总数超过数超过22亿个碱基对，其中包括亿个碱基对，其中包括19种不同生种不同生物体的完整序列、近物体的完整序列、近9000个已知功能或已推个已知功能或已推测功能的人类基因序列。测功能的人类基因序列。基因序列数
2、据库正在以前所未有的速度迅速基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。增长。2然而如何充分利用新序列信息资源，怎样然而如何充分利用新序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成为生命科学工命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课题。作者的共同课题。3已建立的诸如已建立的诸如Northern印迹、印迹、RNA酶保酶保护实验、护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量来有狭线印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此，效地利用新的基因组学的资源。为此，
3、必须发展高通量或平行监测基因表达的必须发展高通量或平行监测基因表达的新方法。新方法。基因芯片技术正是在这样的背景下应运基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。而生。4早在早在80年代初期，有人就曾设想利用年代初期，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。检查。5但直到但直到1994年年Pease等人创造的光导原位合成高等人创造的光导原位合成高密、微化的寡核苷酸阵列密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问的制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。世之后，才使该设想逐步成为现实。因
4、此可以说光导因此可以说光导ODTA化学合成法，为基因芯化学合成法，为基因芯片技术奠定了基础。片技术奠定了基础。6现在全世界已有十多家公司从事基因芯片现在全世界已有十多家公司从事基因芯片研究和开发工作，而且已有较为成型的产研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表。公司为代表。图片来自益来基因网图片来自益来基因网:http:/www.el- 图片来自益来基因网图片来自益来基因网:http:/www.el- 2. 基因表达分析基因表达分析随着人类基因组计划的顺利进行，基因组研随着人类基因组计划的顺利进行，基
5、因组研究的重心转了功能基因组学，研究基因的功究的重心转了功能基因组学，研究基因的功能，特别是研究疾病相关基因已成了生物科能，特别是研究疾病相关基因已成了生物科技界的热点。基因表达芯片为此提供了最好技界的热点。基因表达芯片为此提供了最好的技术平台。的技术平台。66对大多数基因而言，对大多数基因而言，mRNA表达水平与表达水平与其蛋白质的水平相对应。其蛋白质的水平相对应。PicturefromIIR:http:/www.inet.uni2.dk/iirrh/IIRhome.htm67一般以一般以Oligo-dT作引物进行作引物进行RT-PCR制备靶基制备靶基因，对细胞内大量基因的因，对细胞内大量基
6、因的mRNA表达差异进表达差异进行检测，从而了解细胞的性质与状态。行检测，从而了解细胞的性质与状态。基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的水平出现的mRNA，且易于同时监且易于同时监测成千上万的基因。测成千上万的基因。68RRRRGG: AB: A=B: ABSample ASample Bpreparation of mRNAlabeled cDNAmixinghybridizationpreparation of mRNAlabeled cDNA基基因因表表达达分分析析示示意意图图69由于生物芯片技术可直接测到由于生物芯片技
7、术可直接测到mRNA的的种类及丰度，所以它是研究基因表达的种类及丰度，所以它是研究基因表达的有力工具。有力工具。基因芯片种包含了几万种人工合成的寡基因芯片种包含了几万种人工合成的寡核苷酸探针或核苷酸探针或cDNA，可检测转录产物可检测转录产物从几个数量级到每个细胞的几个拷贝，从几个数量级到每个细胞的几个拷贝，均能被定量研究，被检测目的基因可多均能被定量研究，被检测目的基因可多达达10,000个。个。70系统微型化，样品需量极小系统微型化，样品需量极小同时研究上万个基因的表达变化，同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高研究效率明显提高能更多地揭示基因之间表达变化能更多地揭示基因之间表达变
8、化的相互关系，从而研究基因与基的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系因之间内在的作用关系检测基因表达变化的灵敏度高，检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表可检测丰度相差几个数量级的表达情况达情况节约费用和时间节约费用和时间713.3.寻找新基因寻找新基因定量检测大量基因表达水平在阐述基因定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗等方面是很有价值的。的诊断及治疗等方面是很有价值的。基因芯片技术在发现新基因及分析各个基因芯片技术在发现新基因及分析各个基因在不同时空表达方面时一项十分有基因在不同时空表
9、达方面时一项十分有用的技术，它具有样品用量极少，自动用的技术，它具有样品用量极少，自动化程度高等优点，便于大量筛选新基因。化程度高等优点，便于大量筛选新基因。72目前，大量人类目前，大量人类ESTs给给cDNA微阵列提供微阵列提供了丰富的资源，数据库中了丰富的资源，数据库中400,000个个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。的功能分析。734.4.突变体和多态性检测突变体和多态性检测肿瘤和遗传性疾病
10、发生的根本原因是由于遗肿瘤和遗传性疾病发生的根本原因是由于遗传物质发生了改变。传物质发生了改变。检测基因突变对于阐明肿瘤与遗传病的分子检测基因突变对于阐明肿瘤与遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。机制、疾病的早期诊断具有重要意义。74以往研究突变和多态时多采用以往研究突变和多态时多采用PCR-SS-CP、手工或自动测序、异源双链分析、手工或自动测序、异源双链分析、蛋白截短检测等方法，所有这些都需经蛋白截短检测等方法，所有这些都需经过电泳环节，不能满足大规模、低消耗过电泳环节，不能满足大规模、低消耗和自动化的要求。和自动化的要求。应用基因芯片方法检测时可克服上述不应用基因芯片方法检测时
11、可克服上述不足，且与足，且与DNA聚合酶或连接酶结合检测聚合酶或连接酶结合检测时可获得更高的分辨率时可获得更高的分辨率75Hacia等用含有等用含有96,000个寡核苷酸探针的基因个寡核苷酸探针的基因芯片来检测遗传性乳腺癌基因芯片来检测遗传性乳腺癌基因BRCA1第第11外外显子显子3.45kb长度内的所有可能的杂合性突变，长度内的所有可能的杂合性突变，包括碱基替换及小的插入、缺失等，并借此包括碱基替换及小的插入、缺失等，并借此确定发病风险。确定发病风险。基因芯片也可用于肺癌、卵巢癌、前列腺癌、基因芯片也可用于肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤的研究中，为肿瘤基因组结肠癌等多种肿瘤的研究中
12、，为肿瘤基因组解剖计划（解剖计划（CGAP）的完成提供重要的技术的完成提供重要的技术支持。支持。76Lipshutz等证明基因芯片可用来筛查等证明基因芯片可用来筛查HIV病毒的蛋白酶基因和反转录酶基因病毒的蛋白酶基因和反转录酶基因的突变。这些突变能引起对抗生素，如的突变。这些突变能引起对抗生素，如AZT等的抗性。等的抗性。Affymetrix公司已制造出商用公司已制造出商用HIV芯片，芯片，包括包括1,040个蛋白酶和反转录酶基因，用个蛋白酶和反转录酶基因，用来研究病毒抗性发展过程中的碱基突变。来研究病毒抗性发展过程中的碱基突变。77Chee等制造了含有等制造了含有135,000个个25-me
13、r探针的基探针的基因芯片来探测因芯片来探测16.6kb的人线粒体基因组。共的人线粒体基因组。共分析了分析了10个样本，检出个样本，检出505个多态。每个样本个多态。每个样本可在可在12min内阅读完毕，正确率达内阅读完毕，正确率达99%。据估。据估测，每一工作日可阅读测，每一工作日可阅读40个线粒体基因组，个线粒体基因组，大大高于现在凝胶测序仪可达到的每日大大高于现在凝胶测序仪可达到的每日2个基个基因组水平。因组水平。基因芯片除可用于研究基因芯片除可用于研究mtDNA基因突变以及基因突变以及民族内和民族间民族内和民族间mtDNA的多态性外，还可用的多态性外，还可用来揭示来揭示mtDNA基因的表
14、达与神经性疾病和长基因的表达与神经性疾病和长寿等关系。寿等关系。78SBH技术可大规模地检测和分析技术可大规模地检测和分析DNA的变异及的变异及多态性。多态性。PicturefromNCBIwebsite.突变突变79基因芯片技术是一项高效、准确的基因芯片技术是一项高效、准确的DNA序列分析技术，将基因芯片技术用于检序列分析技术，将基因芯片技术用于检测分子突变，不仅可准确地确定突变位测分子突变，不仅可准确地确定突变位置和类型，更可同时检测多个基因，及置和类型，更可同时检测多个基因，及至整个基因组的突变，其快速高效是其至整个基因组的突变，其快速高效是其它方法无法比拟的。它方法无法比拟的。80基因
15、芯片技术用于基因组研究可创造第基因芯片技术用于基因组研究可创造第三代遗传图，即将遗传病表型于三代遗传图，即将遗传病表型于DNA上上特定的基因序列联系起来。特定的基因序列联系起来。以单核苷酸多态性（以单核苷酸多态性（SNPs)为标记可帮为标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，若能助区分两个个体遗传物质的差异，若能将所有将所有SNPs全部信息装入生物芯片则可全部信息装入生物芯片则可检测到与之相关的基因间差异。检测到与之相关的基因间差异。815.5.后基因组研究后基因组研究基因组测序完成后，未知基因的功能研基因组测序完成后，未知基因的功能研究是一个十分诱人的后基因组研究课题。究是一个十分诱人的后基因
16、组研究课题。斯坦福大学的斯坦福大学的Davis研究小组的研究提示研究小组的研究提示DNA芯片技术将来可能应用于人类基因芯片技术将来可能应用于人类基因组测序完成后未明开放读码框架组测序完成后未明开放读码框架ORF生生物学功能的研究，可能会对深刻认识生物学功能的研究，可能会对深刻认识生命现象及药物设计带来重大影响。命现象及药物设计带来重大影响。82Davis研究小组利用研究小组利用DNA芯片技术对酵母缺失芯片技术对酵母缺失突变株进行定量分析以确定酵母全序列测定突变株进行定量分析以确定酵母全序列测定完成后新发现的完成后新发现的ORF的生物学功能。他们应的生物学功能。他们应用基因打靶技术产生多个用基因打靶技术产生多个ORF缺失的酵母突缺失的酵母突变株，并在缺失变株，并在缺失ORF旁引入旁引入20个核苷酸的标个核苷酸的标志序列作为缺失志序列作为缺失ORF的身份标志，谓之的身份标志，谓之分子分子条形码条形码（molecularbarcodes），），分子条形分子条形码可与基因芯片上的探针进行杂交以便于筛码可与基因芯片上的探针进行杂交以便于筛选。这样，选。这样，ORF的功能测试可通过一次杂交的功能测
