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1、目的：目的：(浓缩；浓缩；(初步纯化初步纯化 ；(将已纯化的将已纯化的产品由液态变成固态产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。，加以保存或进一步处理。固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。广泛应用在工业上和实验室中。概述n固相析出分离法：生化物质目的物经常作为溶质存在于溶液中，改变溶液条件，使它以固体形式从溶液中分离的操作技术。n 固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉
2、析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。用的方法。l l优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高l l缺点：针对复
3、杂体系而言，分离度不高、选择性不强缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 盐析法 有机溶剂沉淀法固相析出法 等电点沉淀法 结晶法 其它多种沉淀法n结晶法：析出物为晶体。n沉淀法：析出物为无定形固体。固相析出法分类固相析出法分类n第一节 盐析法n第二节 有机溶剂沉淀法n第三节 其它沉淀方法n第四节 结晶第一节 盐析法n一、基本原理n二、影响因素n三、盐析操作定义：盐析法是利用各种生物定义：盐析法是利用各种生物分子分子在浓盐溶液中溶解度的在浓盐溶液中溶解度的差异差异，通过向溶液中引入一，通过向溶液中
4、引入一定数量的中性盐，使定数量的中性盐，使目的物目的物或或杂蛋白杂蛋白以沉淀以沉淀析出析出，达到，达到纯化目的的方法。纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高；沉淀含大缺点：分辨率不高；沉淀含大量盐析剂，要除盐；产生氨量盐析剂，要除盐；产生氨的恶臭的恶臭6两种现象：两种现象：盐溶盐溶：低盐情况，：低盐情况，盐离子强度的增盐离子强度的增高，蛋白质溶解高，蛋白质溶解度增大度增大盐析盐析：高盐，盐离：高盐，盐离子强度增加，蛋子强度增加，蛋白质白质溶解度减小溶解度减小72022/6/18南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院82022/6/18南
5、京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院9一、基本原理一、基本原理10盐析作用（salting out）原理n破坏双电层：q在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。n破坏水化层：q中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白质溶解度蛋白质溶解度，g/Lg/L； 盐离子强度盐离子强度, , C Ci ii i离子浓度，离子浓度，mol/Lmol/L；Z Zi ii i离子化合价；离子化合价；
6、 常数常数, ,为纵坐标上的截距为纵坐标上的截距; ;K Ks s盐析常数盐析常数。12 盐析和盐析和K KS S盐析盐析右图示：盐离子浓度与蛋白质溶解度关系曲线，在盐析区，符合公式n两种类型：两种类型：（1 1）在一定的）在一定的pHpH和温度下改变离子强度（盐浓度）和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作进行盐析，称作KsKs盐析法盐析法。 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。（2 2）在一定离子强度下仅改变）在一定离子强度下仅改变pHpH和温度进行盐析，和温度进
7、行盐析，称作称作盐析法盐析法。 由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，后期分离（结晶）分辨率更高，后期分离（结晶）13二、影响盐析的因素二、影响盐析的因素1.无机盐的种类在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸柠檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOC
8、OO- - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- -阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高价阳离子高价阳离子阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子l盐析用盐的选择l l盐析作用要强盐析作用要强盐析作用要强盐析作用要强l l盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度l l盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的l l来源丰富、经济来源丰富、经济来源丰富、经济来源丰富、经济盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠盐析中常用的盐：硫酸铵
9、、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂u（1 1） 价廉价廉 ；u（2 2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。n缺点：n（1）水解变酸；n（2）高pH 释氨，腐蚀；n（3）残留产品有影响。n不同种类蛋白质所需的无机盐量不同n先后加入不同量无机盐分级沉淀蛋白质2.溶质（蛋白质等）种类：Ks、不同蛋白溶解度与离子强度的关系盐析分布曲线盐析分布曲线18n蛋白质浓
10、度不同：所需无机盐用量不同n蛋白质浓度高：所需无机盐量少n制成品：可适当高浓度，但浓度过高，易共沉淀n重叠蛋白分级：适当稀释，共沉淀小，但回收率降低。3.溶质（蛋白质等）浓度：23%不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线n无机或稀盐溶液：T蛋白质溶解度n高盐溶液： T蛋白质溶解度n蛋白质：室温盐析n对温度敏感的酶，0C4C4.温度：温度对溶解度的影响5.pH：nPl盐析n注意高盐下pl的偏移：与负离子结合向低pH偏移，与正离子结合向高pH偏移n利用蛋白质pl的不同：可分级沉淀蛋白质三、盐析操作三、盐析操作1.盐析用盐的浓度表示硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：1 1）加入固体
11、盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；使其完全溶解和防止局部浓度过高；2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵先将盐
12、析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。故多用于结晶。盐析用盐量的盐析用盐量的表征表征- - -饱和度：饱和度：uu饱和度（饱和度（饱和度（饱和度（SaturationSaturationSaturationSaturation）的概念：）的概念：）的概念：）的概念： 以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：25252525
13、0 0 0 0C C C C时，硫酸铵的饱和浓度是时，硫酸铵的饱和浓度是时，硫酸铵的饱和浓度是时，硫酸铵的饱和浓度是767g/L767g/L767g/L767g/L定义为定义为定义为定义为100%100%100%100%饱和度饱和度饱和度饱和度u目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。或饱和浓度可通过实验确定。u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%85%饱和度时，溶解度都小于饱和度时，溶解度都小于 0.l mg0.l mgL L，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在范
14、围在40%-60%40%-60%之间。之间。调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表n盐析方法：l1）分步盐析法(不同的盐浓度)l2）重复盐析法l高蛋白质浓度下共沉淀重复盐析提高纯度l3）反抽提法(相同盐浓度)2、盐析方法和注意事项n分级盐析法n不断提高盐浓度：不同蛋白质分级沉淀n低饱和度：除杂蛋白，高饱和度：沉淀目的物血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出单酶盐析曲线双酶盐析曲线n反抽提法n共沉淀较低浓度盐溶液溶杂蛋白大肠杆菌RNA聚合酶的制备n防止“局部过浓”：慢加，搅拌n温度：不宜过低，室温
15、1025C，易失活：010Cn时间：沉淀需经一段老化时间（1小时）后分离注意事项：第二节 有机溶剂沉淀法一、基本原理二、影响沉淀效果的因素l l概概念念：在在含含有有溶溶质质的的水水溶溶液液中中加加入入一一定定量量亲亲水水的的有有机机溶溶剂剂，降降低低溶溶质质的的溶溶解解度度，使使其沉淀析出。其沉淀析出。l有有机机溶溶剂剂对对于于许许多多蛋蛋白白质质（酶酶）、核核酸酸、多多糖糖和和小小分分子子生生化化物物质质都都能能发发生生沉沉淀淀作作用用，是是较较早早使用的沉淀方法之一。使用的沉淀方法之一。l优点：优点：l1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在
16、一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；窄的有机溶剂浓度下沉淀；l2 2）溶剂易除去）溶剂易除去l3 3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；l缺点：缺点：l1 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，l2 2）操作要求在低温下进行。）操作要求在低温下进行。l3 3）成本高，）成本高，需需防火防爆防火防爆l总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。盐析法普遍。一、基本原理n1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。n 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 n脱水作用比静电作用强一些溶剂的介电常数一些溶剂的介电常数 34二、影响沉淀效果的因素1.有机溶剂种类及用量n能与水无限混溶n介电常数小、沉淀强n变性小n毒性小，挥发性适中常用：乙醇、丙酮（挥发肝毒性着火点低）和甲醇（口服毒性） 介电常数：无水乙醇24，甲醇33，丙酮22乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于
