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1、序号： 编码： 第十届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书作品名称：用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术 快速检测H5亚型鸭流感病毒 学校全称： 华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）： 谢义涵 吴永锋 周穗婷 甘燕贞 李宝红 冀君 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 说 明1申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表
2、。所有申报者可根据情况填写C表。3表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4序号、编码由第十届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上（文章版面尺寸14.522cm），附于申报书后，论文不超8000字，调查报告不超15000字。6作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A2申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写；2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍
3、管理部门签章视为申报者情况的确认。申报者代表情况姓名谢义涵性别男出生年月1986年12月学校华南农业大学系别、专业、年级05级动物科学(生物工程方向)学历本科学制4年入学时间2005年9月作品名称用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测H5亚型鸭流感病毒毕业论文题目H5亚型鸭流感病毒RT-PCR方法的建立通讯地址华南农业大学动物科学学院邮政编码510640办公电话常住地通讯地址华南农业大学华山宿舍24栋206邮政编码510640住宅电话13824487106其他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位吴永锋男24本科华南农业大学动物科学学院周穗婷女23本科华南农业大学动物科学学院甘燕贞
4、女22本科华南农业大学动物科学学院李宝红女21本科华南农业大学动物科学学院冀君男24本科华南农业大学动物科学学院资格认定学校学籍管理部门意见以上作者是否为2009年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是否 （部门签章）2009年4 月13 日院、系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果是否负责人签名：2009年4 月13 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士
5、研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测H5亚型压流感病毒作品分类（ D）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路目的是建立一种快速、简便、特异、灵敏的适合于基层实验室使用的H5N1亚型鸭流感病毒的检测方法。基本思路:根据Genbank中注册的H5N1亚型流感病毒HA基因保守
6、区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件, 扩增产物加入核酸染色剂SYBR green，根据颜色反应判断结果（检测结果：橙黄色为阴性，偏绿色为阳性）；还可以加入焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀，根据反应管中浊度的变化判断结果，从而建立一种新型的结果肉眼可视的鉴别鸭流感病毒的方法。作品的科学性、先进性及独特之处近两年来，LAMP方法已广泛使用与各种病毒的快速检测。本项目的指导老师谢青梅已建立了鸭瘟的LAMP检测方法，研究论文发表在“Research in Veterinary Science”上，该研究具
7、有科学性和先进性。该研究建立的LAMP 方法的优点:(1)只需一恒定温度就能扩增反应。不需要特殊试剂,不需要预先进行双链DNA 的变性；(2)特异性高；(3)快速、高效扩增； (4)步骤简单 （5）设备要求简单，不需要昂贵的PCR仪和凝胶成像系统；(6)鉴定结果可用肉眼观察，适用于基层简单实验室使用。这也是本项目的独特之处。作品的实际应用价值和现实意义为广大基层养殖户、畜禽场实验室建立一种快速、准确、简便的鸭流感病毒的鉴别诊断新方法，快速、及时地完成该疫病的检测工作。学术论文文摘鸭流感的暴发和流行给畜牧业造成了巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。本
8、研究建立一种新型、简便、灵敏且特异的环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification Method，RT-LAMP）用于H5亚型鸭流感病毒的检测。根据Genbank中注册的H5N1亚型鸭流感病毒HA基因保守区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件，等温扩增反应条件为65 保温60min。反应结果肉眼可见。在扩增产物加入焦磷酸离子和溶液中镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀，可见反应管中浊度的变化；或者在扩增后产物加入核酸染色剂SYBR green，检测结果阳性呈绿色，阴性为橙黄色
9、；同时用特异性内切酶Kpn进行酶切鉴定。用已建立的RTLAMP技术检测临床样品，检测结果与RTPCR方法符合率均达到100。RT-LAMP技术整个检测过程只需12h，不需要贵重的PCR仪和成像系统，仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验，验证了建立RT-LAMP技术可以作为一种操作简单，灵敏性、特异性高的检测H5亚型鸭流感病毒的技术，适合于检验设备简陋的生产厂场、基层检验检疫单位和防疫部门使用。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励2009年“挑战杯”华南农业大学大学生课外学术科技作品竞赛“特等奖”鉴定结果请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值
10、的现有技术及技术文献的检索目录Dukes JP, King DP, Alexandersen S.Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. Arch Virol,2006,(151):1093-1106曾冰冰，肖凯军，石 磊等. LAMP方法在食品微生物检测中的应用. 现代食品与药品杂志，2007，17（1）：2225申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）用逆转录环介导等温扩增（RT-LA
11、MP）新技术快速检测H5亚型鸭流感病毒科研管理部门签章 年 月 日 C.当前国内外同类课题研究水平概述说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写；2.填写此栏有助于评审。鸭流感是由禽流感病毒引起的一种烈性传染病, 鸭流感不仅严重影响养鸭业的发展, 而且会影响人类健康。建立快速，敏感，特异的检测鸭流感病毒的方法对于防控鸭流感有着重要意义。Notomi T等(2000)开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(LAMP)。其特点是针对靶基因的6个区域, 设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温(65左右)中反应1h，即可完成核酸扩增反应，
12、反应结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪,可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控(Manmohan et al，2004；Yasuyoshi et al，2004； Dukes et al，2006)。也有研究者通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果（Dukes et al，2006)。而不需模板热变性(Nagamine et al，2001)、长时间温度循环、凝胶电泳、紫外观察等过程。目前，国外已有较多的此类报道，并建立了专门的官方网站。而国内起步较晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引进LAMP法检测胚
13、胎的性别(王海浪等，2003)。国内外有许多文献报道该技术在不同细菌（Hung et al，2005）及病毒检测中成功应用的实例，如对西尼罗病毒、SARS病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山药嵌纹病毒的检测以及登革病毒的分型等（Hong et al，2004；Manmohan et al，2004；Shiro et al，2004； Manmohan et al，2005； Motoko et al, 2005；J.P.Dukes et al，2006；Ji jun et al,2008）。同时，人们还在不断对LAMP技术进行改良，使其能在疾病基因诊断、食品分析(曾冰冰等，2007)和环境监测等领域
14、更好地发挥作用。国外有报道用RTLAMP技术检测人流感H1、H2和H3亚型流感病毒（Leo et al，2005），还用于鉴定流感A、B型的诊断（Masahiro et al，2006）。国内还未见用于该方法用于鸭流感病毒的检测。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写；2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）；3推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名毕英佐性别男年龄62职称教授、博导工作单位华南农业大学动物科学学院通讯地址广州天河五山483号华南农业大学动物科学学院邮政编码510642单位电话020-85280283住宅电话020-85280721推荐者所在单位签章毕英佐老师是我校教授、博士生导师。 （签章）2009 年4月13 日请对申报者申
