《《分子生物学载体》PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《分子生物学载体》PPT课件（93页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章第四章 基因工程载体基因工程载体 载体载体载体载体 （VectorsVectors）在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体进入受体细胞的细胞的DNA分子叫载体。分子叫载体。载体是载体是DNA双链分子。双链分子。载体载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可转入，并可转入宿主细胞中，使外源宿主细胞中，使外源DNA与载体与载体DNA共同扩增共同扩增。载体的功能载体的功能1. 为外源基因提供转入受体细胞的转移能力；为外源基因提供转入受体细胞的转移能力；2.
2、 为外源基因提供在受体细胞中的复制或整合为外源基因提供在受体细胞中的复制或整合能力；能力；3. 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达提供必要的条件能力。提供必要的条件能力。理想载体至少必备的条件理想载体至少必备的条件 能在宿主细胞中自主复制能在宿主细胞中自主复制 容易进入宿主细胞容易进入宿主细胞 容易插入外来核酸片段容易插入外来核酸片段 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性 （可转移性）（可转移性）目前的主要载体
3、目前的主要载体 质粒（质粒（Plasmid） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（Cosmid） 动物病毒（动物病毒（virus） 细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC) 酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC) 大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒 独立于染色体以外的能独立于染色体以外的能独立于染色体以外的能独立于染色体以外的能自主复制、自主复制、自主复制、自主复制、并能被稳定遗并能被稳定遗 传的一类传的一类双链闭合环状双链闭合环状双链闭合环状双链闭合环状DNADNA分子。分子。分子。分子。 存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、
4、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。 分子量：分子量：分子量：分子量： 1-1-300-300 kbkb。 编码基因少：编码基因少：编码基因少：编码基因少： 2323个中等大小的蛋白质。如：个中等大小的蛋白质。如：个中等大小的蛋白质。如：个中等大小的蛋白质。如： 抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的 特性（非必须）。特性（非必须）。特性（非必须）。特性（非必须）。 环形状：双链环状环形状：双链环状环形状：双链环
5、状环形状：双链环状DNADNA。 质粒（质粒（plasmid）质粒质粒DNA的空间构型的空间构型 SC构型构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形两条核苷酸链均保持着完整的环形 结构，结构，DNA呈现超螺旋。呈现超螺旋。 OC构型构型:两条链中只有一条保持着完整的环两条链中只有一条保持着完整的环 形结构，另一条链出现缺口，称之形结构，另一条链出现缺口，称之 为开环为开环DNA。 L 构型构型: DNA双链均发生断裂而形成线性双链均发生断裂而形成线性分分 子。子。 质粒空间构型与电泳速率质粒空间构型与电泳速率质粒空间构型与电泳速率质粒空间构型与电泳速率 分子量相同的，分子量相同的，分子量相同的，分子
6、量相同的，scDNAscDNA最快、最快、最快、最快、l DNAl DNA次之、次之、次之、次之、ocDNAocDNA最最最最 慢。慢。慢。慢。SCSCOCOCL L1.1 质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性 1. 自主复制性自主复制性 携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（ori），它能独），它能独立于宿主细胞的染色体立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。而自主复制。质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行复制系统进行自主复制。自主复制。2. 生物不相容性（生物不相容性（ Incompatibility ）有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但有时不同的
7、质粒可同时共存在于一个细菌内，但有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但同群质粒同群质粒同群质粒同群质粒（不同的，但亲缘性高）不能共存于同（不同的，但亲缘性高）不能共存于同（不同的，但亲缘性高）不能共存于同（不同的，但亲缘性高）不能共存于同一细胞一细胞一细胞一细胞，这种现象称为质粒的，这种现象称为质粒的不相容性不相容性。同群质粒同群质粒同群质粒同群质粒含有相似复制子结构的不同质粒。含有相似复制子结构的不同质粒。以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101
8、、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性质粒的不相容性分子机制质粒的不相容性分子机制两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最
9、终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致
10、使两种质受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。后的细胞分裂周期中更具优势。后的细胞分裂周期中更具优势。后的细胞分裂周期中更具优势。3 3 3 3. . . .可转移性可转移性可转移性可转移性 部分质粒含有部分质粒含有部分质粒含有部分质粒含有tratratratra基因，指令宿主细胞基因，指令宿主细胞基因，指令宿主细胞基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受产生菌毛，合成细胞表
11、面物质，促使宿主细胞与受产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细胞中。胞中。胞中。胞中。4.4.4.4.稳定性稳定性稳定性稳定性 质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。5.5.5.5.寄生性寄生性寄生性寄生性 质粒只能在宿主的细胞内复制。质粒只能在宿主的细胞内复制。质粒
12、只能在宿主的细胞内复制。质粒只能在宿主的细胞内复制。6.6.6.6.可扩增性可扩增性可扩增性可扩增性质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性7. 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记 野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标记上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：加性状，包括：物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具
13、有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。质粒的生物学基本特性质粒的生物学基本特性1.2 1.2 质粒的类型质粒的类型质粒的类型质粒的类型（1 1）按转移性分）按转移性分）按转移性分）按转移性分 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等质粒等 非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。生接合作用。
14、值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由bom 和和mob 基因决定。基因决定。1.2 1.2 质粒的类型质粒的类型质粒的类型质粒的类型（2 2）按复制机理分：按复制机理分：按复制机理分：按复制机理分：严紧控制型质粒，严紧控制型质粒，严紧控制型质粒，严紧控制型质粒，松弛控制型质粒松弛控制型质粒松弛控制型质粒松弛控制型质粒。 严紧型复制质粒严紧型复制质粒严紧型复制质粒严紧型复制质粒（stringent plasmidstringent plasmid
15、）严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，复复复复制随细菌染色体的复制同步进行。制随细菌染色体的复制同步进行。制随细菌染色体的复制同步进行。制随细菌染色体的复制同步进行。特点：特点：特点：特点：拷贝数少，只有拷贝数少，只有拷贝数少，只有拷贝数少，只有1 - 3 拷贝拷贝拷贝拷贝（接合型质粒分子量大，（接合型质粒分子量大，（接合型质粒分子量大，（接合型质粒分子量大， 一般属严紧型）。一般属严紧型）。一般属严紧型）。一般属严紧型）。 松弛型复制质粒松弛型复制质粒松弛型复制质粒松弛型复制质粒（relaxed plasmidrelaxed p
16、lasmid）松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制，独独独独立于细菌细胞而自主复制。立于细菌细胞而自主复制。立于细菌细胞而自主复制。立于细菌细胞而自主复制。特点：特点：特点：特点：拷贝数多，通常有几十乃至几千份拷贝拷贝数多，通常有几十乃至几千份拷贝拷贝数多，通常有几十乃至几千份拷贝拷贝数多，通常有几十乃至几千份拷贝（非接合型（非接合型（非接合型（非接合型 质粒分子量小，一般属松弛型）。质粒分子量小，一般属松弛型）。质粒分子量小，一般属松弛型）。质粒分子量小，一般属松弛型）。 作为载体的质粒应该是松弛型的作为载体的质粒应该是松弛型的作为载体的质粒应该是松弛型的作为载体的质粒应该是松弛型的 质粒的命名质粒的命名质粒的命名质粒的命名 用小写字母用小写字母p代表质粒，在代表质粒，在p字母后面用两字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。后面的数字是构建质粒的编号。验室名称。后面的数字是构建质粒的编号。 如：如：pUC18和和pBR322。 天然质粒的局限性天然质粒的局限性天然质粒的
