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1、vectors？vectors本质？本质？在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为细胞复制、整合或表达的工具称为载体载体。1.载体载体(Vectors)载载体体的的本本质质是是DNA。经经过过人人工工构构建建的的载载体体，不不但但能能与与外外源源基基因因相相连连，导导入入受受体体细细胞胞，而而且且还还能能利利用用本本身身的的调调控控系系统统使使外外源基因在新的细胞中源基因在新的细胞中复制复制。1. 运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞2. 为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力
2、3. 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only of itself but also of the gene that it carries. 载体的功能：载体的功能：（2）在宿主细胞内能独立复制。）在宿主细胞内能独立复制。replicate independently in host cell（3）有一段多克隆位点。）有一段多克隆位点。Multiple cloning sites外源外
3、源DNA插入其中不影响载体的复制。插入其中不影响载体的复制。2.基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求（4）有选择性标记。）有选择性标记。selectable marker（5）分子量小，拷贝数多。）分子量小，拷贝数多。Low molecules and multiple copies（6）容易从宿主细胞中分离纯化。）容易从宿主细胞中分离纯化。Easy isolation and purification from host cells.（1）具有对受体的可转移性。）具有对受体的可转移性。transferable复制位点复制位点选择性标记选择性标记克隆位点克隆位点克隆载体克隆载体表达载体表达
4、载体表达调控元件表达调控元件必必须须的的3.基因工程对载体的要求组成部分基因工程对载体的要求组成部分基因工程中常用的载体有基因工程中常用的载体有4类：类：3.载体的种类载体的种类质粒（质粒（plasmid） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（动物病毒（virus） 第一节第一节克隆载体克隆载体一、质粒（一、质粒（plasmid）存存在在于于多多种种宿宿主主细细胞胞中中、独独立立于于染染色色体体以以外外的的可可自自主主复复制制的的双链闭合环状双链闭合环状DNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、
5、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒质粒的命名规则质粒的命名规则天然存在的质粒：其符号的第一个字天然存在的质粒：其符号的第一个字母要大写，并不用斜体字，书写时要母要大写，并不用斜体字，书写时要用括号括起来，如（用括号括起来，如（ColE1）。）。重组质粒：通常是用小写重组质粒：通常是用小写p后加两个大后加两个大写字母表示写字母表示.（一）质粒（一）质粒（Plasmid）的命名）的命名构建质粒的研究人员或完构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构成此项工作的研究机构例如：pSC101 pSC101plasmid质粒质粒质粒试验质粒试验研究类号研究类号StanleyCohen（
6、一）质粒（一）质粒（Plasmid）的命名）的命名（1）分子小：）分子小：（二）（二）质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1-200kb质粒质粒DNA仅占细胞染色体组一小部分，一般约仅占细胞染色体组一小部分，一般约1-3左右。左右。不同质粒不同质粒DNA的分子量差异相当显著，质粒的分子量差异相当显著，质粒DNA分子小的不足分子小的不足2kb，大的可达，大的可达100kb以上，以上，多数在多数在10kb左右左右。最小的仅能。最小的仅能编码编码23种中等大小的蛋白质，两者之间相差竞达上百倍。种中等大小的蛋白质，两者之间相差竞达上百倍。（二）（二）质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性（2）编
7、码基因少：）编码基因少：2-3个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。（3）环状：）环状：双链环状双链环状DNA。如抗生素抗性等，赋予细菌一些额外的特性。如抗生素抗性等，赋予细菌一些额外的特性。（非必须）（非必须）（4 4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型：）质粒的空间构型：）质粒的空间构型：共价闭合环状共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（supercoil）CovalentclosecircularDNA线形线形DNA（linear，lDNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。开环开环DNA（opencircular，ocDNA）（5 5）质粒空间
8、构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：迁移率不同：scDNA最快、最快、lDNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOClDNA（三）质粒的基本性质（三）质粒的基本性质（1）严紧型质粒（严紧型质粒（stringentplasmid）拷贝数少拷贝数少，只有，只有1-3个拷贝。个拷贝。（2）松弛型质粒（松弛型质粒（relaxedplasmid）拷贝数多拷贝数多，一般，一般10个以上。个以上。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松
9、弛型）。1.复制复制p39质粒的拷贝数质粒的拷贝数：指在正常生长条件下，每个细菌细指在正常生长条件下，每个细菌细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。胞或每条染色体所对应的平均质粒数。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）2.不相容性不相容性（incompatibility）在在没没有有选选择择压压力力的的情情况况下下，两两种种亲亲缘缘关关系系密密切切的的不不同同质质粒粒，不不能能在在同同一一宿宿主主细细胞胞中中稳稳定定地地共共存存的的现现象象。在在细细胞胞的的增增殖殖过过程程中中，其其中中必必有有一一种种会会被被逐逐渐渐地地排排斥斥(稀稀释释)掉。这样的两种质粒
10、称为不相容质粒。掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。前前提提条条件件：只只有有在在确确实实证证明明第第二二种种质质粒粒B已已经经进进入入含含有有第第一一种种质质粒粒A的的寄寄主主细细胞胞，而而它它的的DNA并并不不受受寄寄主主细细胞胞限限制制体体系系的的降降解解作作用用，但但这这两两种种质质粒粒却却不不能能长长期期稳稳定定共共存存，在在这这种种情情况况下下，我我们们才才能能够够说说A和和B是是不不亲亲和和的的质粒。质粒。在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：3.质粒的转移性质粒的转移性（1）接合型质粒接合型质粒（2）非接合型质粒非接合型质粒能自我转移能自我转移不能自我转移不
11、能自我转移如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。原先不存在该质粒的受体菌中。通过接合作用转移到新宿主内，又叫通过接合作用转移到新宿主内，又叫自我转移型质粒自我转移型质粒。（1 1） 接合型质粒（接合型质粒（接合型质粒（接合型质粒（conjugative plasmidconjugative plasmid）分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外所必需的
12、遗传信息外还带有一套控制细菌还带有一套控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转移接合转移的基因的基因大肠杆菌接合大肠杆菌接合（conjunction）Donor cellRecipient cell Conjugative plasmidPilus 菌毛菌毛Plasmid transfer by conjugation between bacterial cells.（ 2 2）非接合型质粒（）非接合型质粒（）非接合型质粒（）非接合型质粒（non-conjugative plasmid non-conjugative plasmid ） R质粒（抗性质粒）质粒（抗性质粒）带有一种或数种带有一种或数种
13、抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获得同样，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（的抗生素抗性性状（resistance）。）。分子量小，拷贝数多，符合基因工程的安全要求分子量小，拷贝数多，符合基因工程的安全要求虽然带有自我虽然带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失去了控所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒制细菌配对和质粒接合转移接合转移的基因，因此不能从一的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。个细胞转移到另一个细胞。带有控制带有控制大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）合成的基因合成的基因 ColCol质粒质粒质粒质粒大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。质粒
14、的大肠杆菌有毒。但但如如果果在在其其寄寄主主细细胞胞中中存存在在着着一一种种接接合合型型的的质质粒粒，非非接接合合型型质质粒粒也也可可以以被被转转移移。这这种种由由共共存存的的接接合合型型质质粒粒引引发发的的非非接接合合型型质质粒粒的的转转移移过过程程，叫叫做做质质粒粒的的迁移作用。迁移作用。（1）如：分子量大，拷贝数低）如：分子量大，拷贝数低（四）质粒载体的构建（四）质粒载体的构建1、天然质粒的局限性、天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长分子长9.1kb。有一个有一个EcoRI酶切位点充当克隆位点，酶切位点充当克隆位点，Tetr 作为筛
15、选标志。作为筛选标志。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）（2 2）筛选标志不理想）筛选标志不理想）筛选标志不理想）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗发突变出抗colicinE1的细胞的细胞.colicinE1能杀死不含能杀死不含ColE1质粒的菌。质粒的菌。2 2、质粒载体的构建：、质粒载体的构建：、质粒载体的构建：、质粒载体的构建：（1）具有复制起始位点（具有复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择标记基因）具有合适的选择标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（）若干限
16、制性内切酶的单一位点（MCS）是筛选的标志。理想的载体应该有两种选择标记基因是筛选的标志。理想的载体应该有两种选择标记基因用来插入外源用来插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功能片断，且插入后不影响复制功能一般选择组装松弛型质粒复制起始位点。一般选择组装松弛型质粒复制起始位点。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数）具有较小的分子量和较高的拷贝数缩短长度缩短长度“轻装上阵轻装上阵”，大于，大于15kb的质的质粒的转化率明显下降粒的转化率明显下降氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性四环素抗性（Tetr）链霉素抗性链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性氯霉素抗性（Cmlr）3 3、质粒的选择标记及其工作原理、质粒的选择标记及其工作原理、质粒的选择标记及其工作原理、质粒的选择标记及其工作原理（1）选择标记）选择标记绝大多数质粒载体都是用抗生素抗性标记：绝大多数质粒载体都是用抗生素抗性标记： 抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性常用抗生素的抗性原理常用抗生素的抗性原理i）氨苄青霉素（）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青
