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1、浅论TDCg白的表达纯化及多克隆抗体的制备【摘要】目的：表达纯化胸腺嚅嚏糖昔酶(TDG)蛋白并制备TDG克隆抗体。方法：PCFT增小鼠TDG(mTDG)基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体，表达并纯化HismTDG融合蛋白。用纯化的HismTDG蛋白免疫兔子产生抗血清，进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体，并检测分析制备的抗体在Westernblotting和免疫荧光分析中的应用。结果：在低温(20C)和低IPTG浓度(mmolL-1)时，HismTDG融合蛋白大部分在可溶上清部分，用亲和层析法分离纯化了HismTDG蛋白，并用纯化的蛋白制备了兔抗TDG抗体，结果显示制备的抗体
2、能够特异性地在免疫分析中使用。结论：本研究纯化了条带单一的并且具有生物学活性的TDG融合蛋白，制备了具有良好特异性的兔抗TDG抗体，为进一步研究TDG的性质、结构和功能奠定了基础。【关键词】胸腺嚅嚏糖昔酶；原核表达；纯化；多克隆抗体AbstractObjective:ToexpressandpurifyTDGprotein,andtopreparetherabbitantibodyagainstthymineDNAglycosylase(TDG)protein.Methods:MouseTDG(mTDGWasamplifiedbyPCRandthenwasinsertedintothefusi
3、onexpressionvectorpET28a(+).AfterbeingexpressedinE.coliBL21,theHismTDGproteinwaspurifiedandusedtoimmunizeantibodywasobtainedthroughaffinitychromatographycolumn,anditsapplicationswereevaluatedthroughWesternblottingandimmunofluorescence:HismTDGfusionproteinwasalmostallsolubleatlowtemperature(20C)andlo
4、wIPTGcondition(mmol-L-1).Thefusionproteinwaspurifiedandusedtoimmunizerabbits,theantibodyagainstTDGwasobtained.Thefurtherresultsshowedthattheantibodyhadagoodspecificityinimmunoassays.Conclusion:WehavepurifiedmTDGfusionproteinwithanobviouslyhomogeneousbandandhighbiologyactivityandpreparedtherabbitanti
5、bodyagainstTDGsuccessfully,whichlaysthefoundationforfurtherstudyonitscharacter,structureandfunction.KeywordsthymineDNAglycosylase;prokaryoticexpression;purification;polyclonalantibodyDNA甲基化联系着基因沉默，是重要的基因转录调控方式和常见的DNAft制后修饰形式，在生长调控和分化中扮演了重要作用1。然而，胞嚅嚏甲基化也是基因组不稳定的一个根源，因为DNA兑甲基化是通过脱氨基途径先形成G:T错配，然后修复G:T错
6、配进行。甲基化胞嚅嚏自发水解脱氨基形成的错配是基因组内源最常见的突变原因之一4-5,而基因组的突变往往导致各种癌症等疾病6-7。幸运的是，所有生物都进化出了修复G:T错配的酶，胸腺嚅嚏糖昔酶(TDG)是一个修复G:T错配的重要蛋白酶。人源TDG蛋白包含410个氨基酸，小鼠的含421个氨基酸，然而，TDG蛋白在SDSPAGE中的条带位置大约在60kD。TDG不仅和SUMO1和SUMO3相互作用，而且能够被它们共价修饰10-12,SUMOL修饰影响了TDG的结构和酶活特征，是TDG发生错配修复过程中所必需的生物学事件13,HeLa细胞样品的Westernblotting结果显示，TDG两条带：一条
7、是TDG带，大约60kD,一条是TDGSIN0条带，大约86kD13。另外，研究报道，TDG定位在细胞核内10,14。为了开展对TDG的研究，我们自己表达并纯化了鼠源的TDG蛋白，并用纯化的蛋白免疫兔子制备了高滴度的多克隆抗血清，进一步亲和纯化抗血清，获得了高质量的antiTDG多克隆抗体，制备的抗体能够在Westernblotting实验中有效地识别细胞及动物组织样品，而且在免疫荧光分析中能够很好地使用。1材料和方法材料实验动物3个月左右健康的新西兰大白兔购自南京农业大学动物中心。菌株与载体大肠杆菌克隆菌株Top10和表达菌株BL21(DE3)由本实验室保存；原核表达载体pET28a(+)购
8、自Novagen公司；pClHAmTDG由实验室构建。试剂逆转录试剂盒、限制性内切酶Ndel和Xhol、高保真PyrobestDNA聚合酶，T4连接酶购自TaKaRa公司;IPTG购自上海生工生物工程技术服务有限公司;DNA回收试剂盒购自上海博彩生物公司；镣(Ni+)亲和介质及SephadexG15购自Pharmacia公司；Lipofectamine2000转染试剂购自Invitrogen公司。其它化学试剂均为分析纯，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。方法原核表达质粒的构建合成构建pET28amTDG需要的pcfI物。TDGNdel：5ggaattccatatggacgcagaggccg
9、cgcgca3;TDGXhoI:5ccgctcgagagcgtggctctcttcttcctg3(画线部分分别为Ndel和Xhol位点)。通过PCFT增方法用高保真PyrobestDNA聚合酶从小鼠cDNAk扩增TD建因片段，经Ndel和Xhol双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离并回收TDG基因片段后，插入Ndel和XhoI酶切回收的pET28a(+)载体，对重组表达质粒进行Ndel、Xhol酶切鉴定和DNAH序，分析其阅读框和编码序列的正确性。HismTDG蛋白的表达与纯化构建好的pET28amTDG被转入表达宿主菌BL21(DE3),挑单克隆到含60从g-ml-1卡那霉素的LB液体培养基过夜活化，
10、然后按1:100的比例转接入1L含60从g-ml-1卡那霉素的LB液体培养基中，37C3h左右到OD600A时，将LB冷却到20C，然后加入IPTG到终浓度为mmolL-1,16h后收集菌液，用40mlTrisHC1缓冲液(50mmolL-1TrisHCl,pH,150mmolL-1NaCl,1mmolL-1PMSF)重悬菌体，超声裂解20min(脉冲5s，间隔10s),13500Xg离心15min。将收集的上清以ml-min-1的速率加载到TrisHC1缓冲液预平衡的Ni+亲和柱，上样完毕后用TrisHC1缓冲液充分洗涤至基线，再分别用含有10mmolL-1和50mmolL-1咪哇的缓冲液洗
11、涤杂蛋白，最后用含250mmolL-1咪口坐的缓冲液洗脱目的蛋白。通过Ni+亲和柱纯化的洗脱蛋白立即使用SephadexG15凝胶柱层析去除咪哇。纯化后的蛋白加入10%勺甘油后，保存在-80C。TDG勺活性分析TDG的活性分析参照文献15进行，T44(5aattgggctcctcgaggaattTgccttctgcaggcatgccccgg3)在5端用丫32PATP标记，然后与G44(5ccggggcatgcctgcagaaggcGaattcctcgaggagcccaatt3)退火形成异源双链，即测活反应的DNAI物。测活反应体系为：50mmolL-lTrisIICl(pII),1mmolL-
12、1DTT,50pg-ml-1BSA,1mmolL-1EDTA3浦油，DN服物nmol-L-1和适量的TDG蛋白，10(1l反应体系37C反应30min,加入(1l1mol-L-1的NaOH90C反应30min,迅速置冰上，短暂离心后，加入5卜l测活loading(90%formamide,10mmol-L-1EDTA,%xylenecyanol,%bromophenolblue)。取10l混合物用14糠丙烯酰胺测序胶分离，Tyhoon9410workstation(Amersham)进行扫描与分析。多克隆抗血清的制备与纯化先取23ml兔子血液作为免疫前阴性对照，用完全弗氏佐剂乳化500从g纯化
13、的TDG蛋白后，皮下多点注射在兔子的背部和颈部，2周后加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次，在加强免疫3次后，用纯化的蛋白做ELISA检测抗体的效价，结果显示1只兔子效价很好，滴度大约为214,另1只的滴度不太好，大约为29。颈部采血处死兔子，收集血清。先用IgGbinding缓冲液(10mmolL-1TrisIIC1,pll)平衡ProteinA柱子，效价较高(214)兔子的血清样品上柱后吸附10min,然后用23倍体积的binding缓冲液洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(mol-L-1glycinebuffer,pH23)洗脱，洗脱下来的IgG用mol-L-1Tris
14、(pH)中和。产生的多克隆抗体加入%勺叠氮钠和20部油后，保存于-80C。细胞培养和转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10和人胚胎肾细胞293T购自AmericanTypeCellCulture(ATCC)，用含有10%、牛血清的DulbeccosmodifiedEaglesmedium(DMEM0养。对于Westernblotting分析，细胞用磷酸钙转染方法；对于免疫荧光分析，细胞用lipofectamine2000转染试剂转染。Westernblotting分析制备细胞或组织样品，进行10%勺SDSPAGE电泳，然后将蛋白电转到PVDF膜上，用5%兑脂牛奶包被1h,再在合适大小杂交袋中，包被一
15、抗室温2h,10min3次洗膜后，包被二抗室温1h,洗膜后用发光液发光，在暗房中剪取合适大小的X线片显影和定影。免疫荧光分析B16F10细胞被铺在含有无菌盖玻片的6孔板中，等细胞长到20%30的寸，用pClHAmTDG转染细胞，转染24h后，用4知勺多聚甲醛4C1h固定细胞，然后含%TritonX100的温热pbs室温45min改变细胞的通透性，再用含3%BSA的PBS溶液室温2h或4C过夜预包被后，用含3%BSA的PBS溶液稀释一抗，4C包被过夜。10min3次洗涤后，用含3%BSA的PBS溶液稀释二抗(1:250)，暗处1h。洗涤后，用PBS稀释的Hochest(1:2000)进行细胞核的
16、染色。5min后，在载玻片上滴加20引甘油，然后将盖玻片倒扣在载玻片上，用荧光显微镜进行观察、拍照。2结果HisidTDg融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定通过参考文献15及自己摸索条件，我们确定HismTDG在低温20c和低iptg浓度mmolL-1时，能够很好地表达并且大部分在可溶上清(图1A)。用Ni+柱亲和纯化，G15分子筛去除咪哇，我们获得了单一条带的HisTDG融合蛋白(图1B),用Bradford法测蛋白浓度，经计算有15mgL-1的得率。进一步通过TDG经典的体外测活反应验证本研究表达纯化的蛋白有良好的G:T错配修复活性（图2）。A:M.蛋白Marker;Lane13.依次为未经IPTG诱导的总蛋白、上清和沉淀;Lane46.依次为IPTG诱导的总蛋白、上清和沉淀。b：纯化的HisuiTDG蛋白。c：纯化的TDG抗体。D:从两家公司购买的TDG亢体的We
