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1、病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程荧光光谱分析仪分析测试中心 陈仕云病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程分子荧光光谱仪A原子荧光光谱仪B病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第一节 荧光光谱分析仪病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、概一、概 述述荧光荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与：某些物质
2、吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样时，再发射过程立即停止，这种再发照射试样时，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（射的光称为荧光（fluorescencefluorescence）。荧光包括）。荧光包括分子荧光和原子荧光。分子荧光和原子荧光。荧光分析法荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。度进行物质的定性与定量分析的方法。荧光光谱仪荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。：采用荧光分析法来测量的仪器。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体
3、内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、概一、概 述述荧光产生机制荧光产生机制 物质的分子吸收了照射光的物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到能量后，处于基态最低能级的分子被激发到电子激发态的各个振动能级。被激发的分子电子激发态的各个振动能级。被激发的分子与周围的分子碰撞，并把部分能量以热能的与周围的分子碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落到单线第二形式传给周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后电子激发态的最低振动能级。然后，由此最由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同低振动能级向基态的各个振
4、动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量时以发光的形式释放出其能量。这种光即为。这种光即为荧光。荧光。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、概一、概 述述1.振动弛豫 2.内转换 3.猝灭 4.系间跨越 s单重态T多重态 1 , 2激发波长激发波长;荧光荧光 3磷光磷光分子去活化过程及荧光产生示意图病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、概一、概 述述荧光分析的特点荧光分析的特点J优点：优点：灵敏度高（可达灵敏度高（可达101012g12g数量级
5、）；数量级）；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操作简便。用样量少、特异性好、操作简便。L缺点：缺点：对温度、对温度、pHpH值等因素变化比较敏感；值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。或与某些试剂作用后发荧光的物质。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二、荧光分析的基本原理（一）激发光谱和荧光光谱（一）激发光谱和荧光光谱 任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，
6、任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即即激发光谱激发光谱（excitation spectrum）和荧光光荧光光谱谱(fluorescence spectrum)。激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量的基础。的基础。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程激发光谱激发光谱：连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质 的激发光谱。 从激发光谱图上可找到 发生荧光强度最强
7、的 激发波长ex。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程荧光光谱荧光光谱：用：用exex作激发光源，并固定强度，测作激发光源，并固定强度，测定不同波长的荧光强度。定不同波长的荧光强度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光强度最强的波长为便得荧光光谱。荧光强度最强的波长为em em 。荧光物质的荧光物质的exex和和emem 是鉴定物质的依据，也是鉴定物质的依据，也 是定量测定中所选用的是定量测定中所选用的 最灵敏的波长最灵敏的波长。病原体侵入机体，消弱机体防
8、御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（二）物质的分子结构和荧光的关系（二）物质的分子结构和荧光的关系强荧光物质的分子结构特征：强荧光物质的分子结构特征： 具有大的共轭具有大的共轭- 双键结构，共轭体系越大，双键结构，共轭体系越大，越容易产生荧光；越容易产生荧光； 具有刚性平面结构；具有刚性平面结构； 具有最低的单线电子激发态，具有最低的单线电子激发态，S S1 1为为- 型；型； 若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起
9、不同程度的病理生理过程三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 荧光光谱仪的工作原理荧光光谱仪的工作原理 在激发光的频率、强度以及液层厚度不变在激发光的频率、强度以及液层厚度不变的情况下，荧光物质所发射的荧光强度与溶液的情况下，荧光物质所发射的荧光强度与溶液的浓度成正比。因此，可以通过测定荧光强度的浓度成正比。因此，可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。来求出该物质的含量。 荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光强弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光度计属于发射光谱仪器。荧光分光光度计属于发射光
10、谱仪器。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 荧光光谱仪分类荧光光谱仪分类荧光光度计（荧光光度计（fluorophotometerfluorophotometer）：采用）：采用滤光片滤光片做做单色器，结构较简单，功能也较差。单色器，结构较简单，功能也较差。荧光分光光度计（荧光分光光度计（fluorospectrophotometerfluorospectrophotometer）：）： 采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，
11、功能较强，但价格远远高于荧光光度计。强，但价格远远高于荧光光度计。 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 FP-6500荧光分光光度计病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 Jasco FP8500 荧光光谱仪病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、荧光光谱仪的原理与分类三、
12、荧光光谱仪的原理与分类 ARL 9800 系列 X射线荧光光谱仪 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程荧光光谱仪的主要结构荧光光谱仪的主要结构激光光源：激光光源：单色器单色器：样品池：样品池：检测器：检测器：记录显示系统：记录显示系统：病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程光源光源激发单色
13、器单色器吸收池吸收池检测放大系统检测放大系统荧光光度计结构示意图0.208发射单色器单色器四、荧光光谱仪的结构病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程荧光分光光度计光路图病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 PF8500 PF8500 荧光光谱仪的性能指标主要包括：荧光光谱仪的性能指标主要包括：灵敏度灵敏度:800:1:800:1波长范围波长范
14、围:Ex:200-850nm Em:200-850nm:Ex:200-850nm Em:200-850nm波长精度波长精度:0.3nm:0.3nm分辨率分辨率:1nm:1nm光谱带通光谱带通:0.3nm:0.3nm信噪比信噪比病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程灵敏度灵敏度灵敏度是指能被仪器检出的最低信号，或某一标准灵敏度是指能被仪器检出的最低信号，或某一标准荧光物质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出荧光物质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出的最低浓度，是仪器最重要的性能指标之一。的最低浓度，是仪器最重要的性能指标之
15、一。多数荧光光谱仪的灵敏度较高，可达多数荧光光谱仪的灵敏度较高，可达1010-10-10g g1010-12-12g g水平，有利于检测体液中的微量物质。水平，有利于检测体液中的微量物质。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程波长范围波长范围波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段，包括激发波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段，包括激发通道波长范围、投射通道波长范围和荧光通道波长通道波长范围、投射通道波长范围和荧光通道波长范围。范围。波长范围越大，应用范围越广。波长范围越大，应用范围越广。一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源，光栅为
16、单一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源，光栅为单色器分光元件，其有效工作波段在色器分光元件，其有效工作波段在200nm200nm1000nm1000nm范围之内。范围之内。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程波长精度波长精度指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符的程度。的程度。特定的激发波长和发射波长是定性分析和定量测定特定的激发波长和发射波长是定性分析和定量测定的基础，因此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标的基础，因此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标之一。之一。目前荧光分光光度计的波长精度误差在目前荧光分光光度计的波长精度误差在（0.2nm0.2nm2nm2nm）范围之内。）范围之内。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程分辨率分辨率指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力，它与波长精指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力，它与波长精度有密切关系，决定着对混合物成分分析特异性的度有密切关系，决定着对混合物成分
