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1、实验三 蓖麻愈伤组织培养【课前预习】 1. 预习灭菌锅的使用方法 2. 预习超净工作台使用方法【目的与要求】 1. 掌握愈伤组织的继代培养方法 2. 学习接种操作技术规范。【实验原理】愈伤组织是指脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生的无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。愈伤组织细胞在适当条件下可以重新进入有序生长和分化状态，分化为完整的植株。所以，可以通过愈伤组织的继代培养，进一步增殖愈伤组织，然后通过愈伤组织进一步分化为完整植株，快速繁殖自然繁殖率较低的经济植物。【实验设备和材料】（1）实验材料： 已诱导分化的蓖麻的愈伤组织块（2）实验试剂： MS培养基母液、常用试剂母液、琼脂、蔗糖、生长
2、调节物质6-BA和NAA母液、蒸馏水、1molL-1HCl、1molL-1NaOH、无菌水、75酒精、（3）实验器材：冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、精密pH试纸（pH5.47.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、组织培养盒、橡皮筋、棉线、电炉、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉等。酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子25cm、手术剪、解剖刀、酒精灯、超净工作台、组织培养剪刀镊子灭菌器，恒温培养箱、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管等。【实验内容与方法】 1）配置培养基 蓖麻愈伤继代培养基配方为：MS基本培养基
3、0.3mg/L NAA0.8mg/L 6-BA0.7琼脂3蔗糖配置方法：计算各组分母液需要的体积数，按次序加入500ml蒸馏水中混合，再加入6-BA,NAA母液，加蔗糖，加琼脂，加热溶解后，定容1L，调pH 6.5。配置总量大量元素(ml)微量元素(ml)有机母液(ml)铁盐母液(ml)蔗糖(g)NAA(ml)6-BA(ml)pH琼脂(g)1L50555303086.57.52）培养基分装高压蒸汽灭菌培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kgfcm-2或0.105 MPa （可在0.105 0.12MPa间，但不得超过0.14 MPa），温度121时
4、保持1530 min左右即可。3) 继代培养前准备工作a) 接种室的清洁和消毒； b) 超净工作台的开机和消毒；b) 剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；c) 实验材料的准备（选择装有无污染已分化出愈伤组织外植体的培养盒摆于净工作台上）4) 愈伤组织继代培养a) 将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体产生的愈伤组织在已灭菌的培养皿中剥离b) 将剥离的愈伤组织转接到愈伤组织增殖培养基上c) 将培养瓶放置在25 全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养。一周后观察结果。5. 注意事项（1）培养基配制过程注意事项1) 玻璃器皿的洗涤。 2、天平的使用。 3、配方中各组分的含量（2
5、）培养基灭菌注意事项1) 灭菌前检查锅内是否有足够的水。 2、培养瓶不能拧得太紧，装锅不可过满。2) 为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。3) 培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。4) 当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。（3）无菌操作过程注意事
6、项1) 操作前要洗手消毒 2) 操作器械要灭菌，使用时可用酒精消毒和灼烧灭菌 3、接种时和封口时在酒精灯前操作附录1 MS培养基配置方法1培养基配制人员注意事项1） 负责培养基母液配制，并确保母液配制无误。2） 负责生产培养基的配制与灭菌，并确保培养基安全。3） 每周一的早上应对pH剂进行校正，并更换探头保护液。4） 负责培养基配制室的清洁与培养基配制用具的清洗。5） 注意协调与其他岗位的工作，必要时给予协助。2培养基配制操作规程1）培养基母液配制培养基采用MS培养基配方，为方便每次培养基配制的操作，实际工作中先按照基本配方配制成几种母液。为保证母液配制准确无误，母液配制时，由两名工作人员一同
7、操作，一人负责配制，一人负责核对，并填写母液配制记录表备查。配制好的母液置于母液贮藏瓶中，在阴凉处贮藏，夏天温度超过25时，应将维生素和甘氨酸母液置于冰箱保存。根据使用量，母液的配制量和配制方法如下：大量元素母液：大量元素使用量大，按基础配方配制20倍母液。取一个2000ml的大烧杯，在烧杯中加入1200ml左右的蒸馏水，按照表1所列成分在天平上依次称取 各成分，每称取一种，即加入到烧杯中，搅拌溶解，然后再加入第二种成分，依此类推。另取一500ml烧杯，将称取的氯化钙倒入其中，加入适量蒸馏水溶解。待氯化钙完全溶解后，将其与其它溶液混合。混合时氯化钙溶液应缓慢加入，边加边搅拌，以防止产生沉淀。表
8、1中各成分混合完毕后，加蒸馏水定容到所配体积，而后充分搅拌23分钟使其混匀。配制好的母液转入大量元素母液贮存瓶中。表1. 大量元素20（倍）母液配方成 分1 L（升）2 L（升）5 L（升）备 注大量元素（ 20）氯化钙一定要单独溶解后再混合，切边混合边搅拌，以免产生沉淀。 KNO3（硝酸钾）38 g76 g190 g NH4NO3（硝酸铵）33 g66 g165 g MgSO47H2O（7水硫酸镁）7.4 g14.8 g37 g KH2PO43.4 g6.8 g17 g CaCl22H2O（2水氯化钙）CaCl2（无水氯化钙）8.8 g6.64 g17.6 g13.28 g44 g33.2
9、g铁盐母液：铁盐溶液用硫酸铁和乙二铵四乙酸钠（EDTA-Na）混合配制成200倍母液，配制不同体积母液药品用量见表2。取2个500ml烧杯，按照母液配制体积所需药量分别称取硫酸铁和EDTA-Na，分别置于不同烧杯中加入适量蒸馏水，不断搅拌使其溶解，然后将，再硫酸铁溶液缓慢加入EDTA-Na溶液中，加热搅拌使其充分鳌合。然后使之冷却再定容，转入棕色贮藏瓶避光保存。 （这个好像还要调pH5.5.然后要放在室外一段时间看有无沉淀）表2. 铁盐200（倍）母液配方1 L（升）2 L（升）4 L（升）5 L（升）铁盐*（200） FeSO47H2O（硫酸铁）5.56 g11.12 g22.24 g27.
10、8 g Na2EDTA7H2O（乙二铵四乙酸钠EDTA-Na）7.46 g14.92 g29.84 g37.3 g微量元素母液：微量元素使用浓度低，一般配制成100倍母液。由于微量元素中硫酸铜和氯化钴浓度极低，为保证称量准确，减少误差，首先将硫酸铜和氯化钴配制成贮备液，在母液配制时按照浓度比例量取二者的贮备液与其它成分混合。具体配方见表3。表3. 微量元素200（倍）母液配方微量元素（ 100）1 L（升）2 L（升）2.5L（升）3L H3BO3（硼酸）1.24 g2.48 g3.1 g3.72g KI（碘化钾）0.166 g0.332 g0.415 g0.498 Na2MoO42H2O（钼
11、酸钠）0.05 g0.1 g0.125 g0.15 MnSO44H2O（硫酸锰）4.46 g8.92g10.65g12.38 ZnSO47H2O（硫酸锌）1.72 g3.44 g4.3 g5.16 CuSO45H2O（硫酸铜）5 ml10 ml12.5 ml15ml CoCl26H2O（氯化钴）5 ml10 ml12.5 ml15ml硫酸铜和氯化钴200倍贮备液配制。500 ml贮备液的配制方法：分别称取500mg硫酸铜和氯化钴，分别置于取2个烧杯中，加入适量蒸馏水溶解后，分别置于2个500 ml的容量瓶中定容至刻度。取2个750ml 的棕色试剂瓶，贴好标签，将定容后的贮备液转入其中。摇动试剂
12、瓶使溶液分散均匀，然后置于冰箱保存。有机母液：维生素母液亦配制成200倍母液，所用3种维生素在各体积母液中的用量见表4。表4. 维生素200（倍）母液配方维生素（100）1 L（升）2 L（升）2.5L（升）3 L（升）肌 醇20 g40 g50 g60g 烟 酸0.1 g0.2 g0.25 g0.3 g盐酸吡哆醇（VB6）0.1 g0.2 g0.25 g0.3 g盐酸硫胺素（VB1）0.02 g0.04 g0.05 g0.06 g甘氨酸0.4 g0.8 g1 g1.2gNAA母液配置：称取10mg NAA先用1-3ml 95%酒精或0.1mol/L的NaOH完全溶解，然后定容于1L容量瓶，转棕色瓶中冰箱中保藏。6-BA母液配置：称取100mg NAA先用1-3ml 0.5-1mol/L的HCl或稀的NaOH完全溶解，然后定容于1L容量瓶，转棕色瓶中冰箱中保藏。母液配制和使用注意事项：l 母液配制的称量必须准确，除大量元素外，均采用分析天平称量。l 母液配制必须采用相应的容量瓶定容，不得使用量筒定容，更不能使用刻度烧杯和其它粗放刻度容器。l 除大量元素母液外，其它母液一律用避光容器（棕色玻璃瓶）贮藏，不能使用透明玻璃瓶贮藏。l 所有母液使用前均要先摇动使其充分混匀再量取。l 母液使用后要及时盖好瓶盖，置于阴凉处。特别注意远离培养基加热器，夏天应将维生素和甘氨酸母液贮藏于冰箱中。
