病原微生物染色法

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1、在组织切片上，显示细菌最常用的染色法是Gram氏染色法，依据染色性状不同，把细菌分为两大类，Gram氏阳性细菌和Gram氏阴性细菌。 分枝杆菌有脂性被膜，用Gram氏染色法染色一般不易着色。为了显示这类杆菌，齐一尼氏石碳酸复红是最常用的经典染色方法。杆菌着色后，具有抗盐酸酒精的脱色作用，故又称抗酸性杆菌，这类细菌在病理学检验中最多见的是结核杆菌和麻疯杆菌。 结核杆菌呈单个或平行聚合排列。 麻疯杆菌与结核杆菌相似，但较短粗。 螺旋体染色目前仍使用经典的Levaditi氏组织块银染法染色。石蜡切片染色则采用Wartrin Starry氏法。 大部分霉菌虽可在HE染色切片中显示出来，但有些则需特殊染

2、色法。如用P.A.S显示白色念球菌，新型隐球菌用Crocott-Gomori氏六胺银法。 一、Gram氏染色法 操纵方法： （1）切片常规脱蜡至水。 （2）结晶紫液中染45秒。 （3）自来水洗。 （4）Gram氏碘1分钟。 （5）在碘丙酮中分化(直到切片无色为止)。 （6）水冲洗。 （7）1%中性红染核1分钟。 （8）自来水速洗。 常规脱水、透明、封固。 结果：Gram氏阳性菌呈蓝玄色，Gram氏阴性菌呈红色。 Gram氏试剂配制。 1结晶紫染液(Lillie氏) 95%酒精 20ml 结晶紫 2g 草酸铵 1g 蒸馏水 80ml 2Gram氏碘液 碘结晶 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300m

3、l 3碘丙酮溶液 Lugot氏碘 2ml 丙酮 98ml Gram氏切片染色(改良法) 操纵方法： （1）石蜡切片脱蜡常规至水。 （2）HE水溶液染色，伊红较正常深。 （3）1%结晶紫滴于切片染5-10分钟。 （4）倾往染液加Lugol氏碘液5-10分钟。 （5）倾往碘液，滤纸稍印干。 （6）苯胺二甲苯(1:1)分化至无色。 （7）二甲苯洗2次。 （8）二甲苯透明、树胶封固。 结果：Gram阳性细菌及纤维素亮蓝色，核兰色，背景淡红色。 试剂配制： 11%龙胆紫或甲紫、结晶紫水溶液。 2Lugol氏碘液。 二、齐一尼氏抗酸杆菌染色法(Zienl-Neelson) 齐一尼氏抗酸杆菌染色法是一种传统

4、的经典抗酸染色法，常用来显示结核杆菌、麻疯杆菌。由于染液的加温，可使石碳酸复红进进分枝杆菌内。再用稀酸脱往背景上的多余红色，如用苏木素来染核，杆菌鲜红色对此清楚。 操纵方法： （1）切片常规脱蜡。 （2）石碳酸复红染液滴于切片上，置酒精灯上，渐渐加温，使出现蒸气约5分钟(或在60下染30分钟)冷却2分钟。 （3）水洗。 （4）1%盐酸酒精分化，切片呈淡桃红色为止(在显微镜下控制)。 （5）流水洗。 （6）苏木素或0.5%次甲蓝水溶液染核。 （7）常规脱水、透明、封固。 结果：抗酸菌红色，核蓝色。 试剂配制： Ziehl-Neelsony氏石碳酸复染液。 碱性品红酒精饱和液(约5.95%) 10

5、ml 5%石碳酸水溶液 90ml 三、抗酸杆菌的荧光法 在组织切片中大量的抗酸杆菌易于见到，少量时则难于寻找，用荧光法则比齐一尼氏染色易于找到。 操纵方法： 切片置进二甲苯，(1份花生油+2份二甲苯更好)脱蜡至水。 在金胺，若丹明溶液中10分钟(60)。 自来水洗。 盐酸酒精分化2分钟。 自来水洗。 0.5%高锰酸钾液中2分钟。 自来水速洗。 吸水纸吸干。 急速进80%酒精洗。 吸水纸吸干。 纯酒精。 二甲苯透明，用荧光封固剂或DPX及中性树胶封固。 结果：抗酸杆菌一明亮的黄色荧光，背景不染色。 试剂配制： 金胺O(Auramino O) 1.5g 若丹明B(Rh oolamlire B) 0

6、.75g 甘油 75ml 酚结晶(50液化) 10ml 蒸馏水 50ml 四、梅毒螺旋体染色法 Levediti氏组织块整体染色法 （1）切取2-4mm厚的组织块在10%福尔马林中固定24小时。 （2）流水冲洗。 （3）95%酒精24小时。 （4）蒸馏水洗至组织下沉为止。 （5）2%硝酸银溶液(暗处)逐日换一次，3-4天。 （6）置于焦性没食子酸福尔马林还原剂1-2天(焦性没食子酸4克，福尔马林5ml加水至100ml)。 （7）洗于蒸馏水。 （8）石蜡切片5微米，脱蜡、封固。 结果：螺旋体玄色，背景竭色。 五、铬酸P、A、S(真菌类染色) 石蜡切片2-3微米，脱腊常规至水。 4%铬酸氧化1小时

7、。 流水冲洗5分钟，蒸馏水洗2分钟。 冷雪夫氏(Cold Sohiff)液，15-20分钟。 0.5%偏重亚硫酸钠水溶液5分钟(更换2次)。 水洗5分钟。 蒸馏水洗，至70%酒精洗2分钟。 醛复红染液30分钟。 95%酒精洗(洗往多余染料)。 蒸馏水洗，进淡绿染液30秒钟。 蒸馏水速洗(镜下观察)。 曲霉菌、念球菌属、细胞浆菌属、隐球菌属为红紫色。曲霉菌丝周边紫红色，弹力纤维紫色，背景绿色。 六、病毒包涵体染色法 1、Mann氏甲基蓝伊红染色法 Mann氏甲基蓝伊红染色法，是一种病毒包涵体的染色法，在HE染色切片上包涵体就能显示出来，用这一染色法则更清楚。 操纵方法： （1）切片脱蜡至水。 （

8、2）用Mann氏染液染色8-24小时(染液要新配制)。 （3）蒸馏水洗。 （4）用碱性酒精分化(40%氢氧化钠2-3滴，无水酒精100ml)约30秒钟。 （5）两酮速脱水。 （6）二甲苯透明、封固。 结果：Negri氏小体红色。 试剂配制： Mann氏染液。 1%甲基兰水溶液 6ml 1%伊红水溶液 6ml 蒸馏水 28ml 2、Nacchiavello氏染色 （1）切片脱蜡至水。 （2）以0.25%碱性品红水溶液染色30分钟。 （3）用0.5%柠檬酸分化约3秒钟。 （4）自来水洗。 （5）用1%亚甲兰作对比染色15-30分钟。 （6）水洗。 （7）脱水、透明、封固。 结果：包涵体、立克次氏体均染红色，其余组织呈蓝色。