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1、.缺血性中风动物模型研究2013级硕士8班 陈林伟 XX中医药大学摘要:实验动物或细胞模型完全模拟人类的中风十分困难,动物模型与临床的拟合具有重要意义。脑缺血动物模型为研究脑缺血后病理过程.病理生理机制及评价潜在的治疗干预效果等提供了极其重要的手段。关键词:缺血性中风；动物模型；大脑中动脉闭塞脑卒中,俗称中风,包括脑出血、脑血栓和脑梗塞等。缺血性中风是由大脑主动脉或其分支血栓形成,或内栓子阻塞引起,且多为大脑中动脉栓塞。利用实验动物或细胞模型完全模拟人类的中风十分困难,过去二十年,经动物模型研究证明有效的700多种药物中,除一种新自由基消减剂外,其余全都未能在三期临床得到阳性结果,从而无法证明
2、其有效性,故研究建立与人类发病机理相近、可长期观察、结果稳定可靠、便于操作、价格低廉而实用的符合人类中风的动物模型成为一个迫切需要解决的问题。1 实验动物的选择在新药研发与脑缺血基础工作中,选择恰当的动物模型是非常重要的。缺血性中风动物模型中使用的实验动物有两大类：即灵长类和啮齿类。对于中风的生理病理的了解,最初来源于中风患者。因此,灵长类动物对中风的基础研究具有重要作用。与人类相似的多脑回灵长类动物种属,在行为和感觉运动整合方面与人类有密切的相似性,是中风基础研究、探索性研究和临床前评价的最佳动物模型。利用非人灵长类动物制备模型,已有了几十年的经验积累,如狒狒。STAIR会议提出,药物一旦用
3、小动物做出阳性结果,应该在较高的物种进行验证,然后才能开始临床试验1。最近报道,利用狨猴模型发现了神经保护药物氯美噻唑。国内也有学者采用光化学法成功造成树鼩局部脑缺血模型呤2,其造模方法亦被多人借鉴采纳。但是,到目前为止,尚无标准化的、被广泛接受的灵长类动物中风模型。与灵长类较大的动物相比,啮齿类动物模型,如大鼠和小鼠,具有价格便宜、来源充足、品种纯化、制作模型方法简单、存活率高、脑血管解剖和生理较接近于人类、易于监测生理参数,脑标本制作容易等多面的优势3。但是啮齿类动物的大脑与人和非人灵长类动物的大脑存在差异,对于相同的缺血损伤的反应可能不同。如何将动物的给药方案扩大到人体一直是个难题,包括
4、给药剂量和疗程。例如啮齿类动物模型在中风后的第一周就可恢复,而人类中风后恢复需要较长的时间,可能需要几个月。给药剂量也存在同样的问题。一些全身给药的药物可根据体重进行校正,而一些蛋白质和生长因子类药物,必须脑内注射给药,可根据大脑表面积或体积进行推算。如果没有灵长类动物模型,以及相应的过渡步骤,从啮齿类动物向人体转换将很困难。2模型评价标准与造模方法由于病因不同、持续时间长短不一、梗死位置的变化、缺血严重程度的差异,以及并发的其他系统性疾病的不同,造成了中风临床症状的多样性。建立一个完全理想的缺血性脑中风模型,几乎是不可能的。因此,选择动物中风模型,最重要的是该模型与中风临床表现的匹配度是多少
5、。应该基本符合以下标准4： 1、缺血过程和病理生理反应与人类中风相似；2、缺血性病灶大小重现性强；3、建模的技术相对容易的,创伤小；4、可以监测生理变量,并可维持在正常范围内；5、可方便获取脑样品,进行病理组织学,生物化学和分子生物学研究；6、费用合理。缺血性中风动物模型分为局灶性脑缺血模型和全脑缺血模型两大类。全脑缺血模型的组织病理学和所观察到的行为障碍显著不同,重现性差。目前基础研究中主要采用局灶性脑缺血模型。局灶性脑缺血模型又分为永久性和暂时性缺血模型两种。无论是永久性还是暂时性缺血,缺血性病灶大小差异都很大,而超过3 h的局部脑缺血是不可逆的5。永久中风模型用来研究没有再灌注作用的脑缺
6、血,而暂时性脑缺血模型的闭塞动脉再灌模型,所产生的后果非常接近人类中风缺血部位再灌注,用于较系统地研究缺血性中风发生后的病理变化、药物的作用机理,以及研制开发新的治疗方法,是目前使用最为广泛的动物模型。目前局灶性大脑中动脉缺血模型的制备方法包括：1、开颅机械闭塞法；2、光化学诱导血栓形成法；3、微栓子栓塞阻断法；4、内皮素-1灌注诱导血管收缩法；5、化学刺激诱导血栓性闭塞法；6、血管内线栓阻断法等。其中以血管内线栓阻断法应用最为广泛。无论使用何种动物,采用何种方法,如何减少组间、个体内差异,都是评价模型成功与否的关键。3局灶性脑缺血模型3.1大脑中动脉电凝阻断模型通过将雄性SD大鼠小颅窗暴露大
7、脑中动脉起始部,在大脑中动脉靠近颈内动脉处将其电凝阻断,造成供应区缺血。为常用的永久性局灶性脑缺血模型。缺血成功率高,重复性好；但手术较复杂,且须开颅,破坏了颅腔完整性,如操作不当,可直接损伤脑组织。理论上可制成再灌注模型,但实际操作较困难6。3.2大脑中动脉线栓法再灌注模型首次描述了线栓法阻塞大鼠大脑中动脉,将尼龙线自雄性SD大鼠的颈外动脉插入,然后将线引入颈内动脉,使其穿过大脑中动脉起始部,阻断大脑中动脉,造成大脑中动脉供应区血流中断,导致局灶性缺血。缺血一定时间后,将栓线慢慢抽出,恢复血流进行再灌注。此法诱发的缺血再灌注和永久性缺血性损伤程度有所差别,永久性缺血后梗死体积较短暂性缺血要大
8、。本法无需开颅避免了手术操作对脑组织的直接刺激作用。方法简单易行,适于对再灌注损伤的病理生理机制研究。目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。优点是无需开颅,属相对非侵入的方法。缺点是需要一定的手术技巧,在以往复杂的操作中常出现动物死亡率高、脑出血或蛛网膜下腔出血、梗死大小不衡定等情况。另外个体差异较大,死亡率高7。线栓法不利之处包括：1、血管破裂和随后蛛网膜下腔出血；2、体温过高；3、不适当的大脑中动脉阻塞。栓线的有机硅涂层和激光多普勒引导下插线可以减少蛛网膜下腔出血的发生。自发高热的产生,被认为发生在大多数动物大脑中动脉阻塞持续2h或更长时间,是与下丘脑损伤有关8。在Longa法的基础
9、上进行了改进,使得制作方法简便,提高了造模的成功率和可重复性,制成稳定均一的MCAO模型9。具体方法为大鼠麻醉后,分离颈总动脉和颈外动脉,将鼠头沿长轴方向扭转向左侧45。,拉直ECA与颈内动脉的夹角。使用头端3 mm硅胶包埋制成0.26-0.3 mm膨大的线栓,插入自CCA与ICA分叉点18 mm。术后2 h进行神经功能评分,均为2分,造模均一性好；术后20 h行TTC染色,示大鼠大脑中动脉皮层分布区产生梗死灶,梗死比为,水肿比为。造模成功率为93.75,死亡率为6.25。线栓法MCAO模型的制备方法,也适用于小鼠10,如转基因和基因敲除小鼠突变体11；在非鼠动物也成功地制备了MCAO模型,如
10、兔；另外探讨非人灵长类动物的MCAO模型的制备方法也十分需要12。3.3光化学法诱导模型本法通过将光敏染料孟加拉红经尾静脉注入后,采用特定光波在颅骨表面做定向照射,形成大脑皮质区梗死13。注入体内的光敏染料在特定光波的作用下发生光化学反应,引起内皮细胞过氧化,释放自由基,导致血管内皮损伤,诱发血小板聚集而形成血栓。用该法后梗死部位可任选,不限于大脑中动脉供血区；操作方便、重复性好；该模型适于研究抗血小板药、抗血栓药及内皮细胞保护剂。但其造成永久性闭塞,无法再灌注。此模型创伤小,动物存活率高,梗死部位及大小易于控制,适合老年卒中患者相关基因及干预治疗的研究。3.4局灶血栓注入法1982年Kudu
11、等14引将血凝块分段并注入颈内动脉,不仅导致了颅内栓塞,而且也引起了颅外栓塞。这可能是由于血凝块弥散到作为颈内动脉主要分支的翼突腭动脉所引起。为防止颅外栓塞,Overguarll等15对该模型进行了改良,结扎了翼突腭动脉、甲状腺动脉、枕骨动脉,将血凝块注入颈总动脉。但这些步骤并不能防止对侧半球栓塞,因为凝血块可通过Wills环到对侧半球。血栓栓塞性中风模型比其他脑缺血模型更接近人类中风,大多数的人类中风是血栓栓塞引起的。另外,血栓模型具有测试溶栓剂的潜力,可更好地评估经历了溶栓的缺血性病变,为研究联合疗法提供了可能,如溶栓剂和神经保护药物16。血栓栓塞缺血的诱导最常见的是由自体血栓进入到颅外动
12、脉达到更远端颅内动脉。在早期血栓模型,人体血液凝块,或悬浮的同源小血块碎片被用来产生栓塞。Wang等17改良了微栓子栓塞阻断法,他们将导管插入颈内动脉,将不同容积的凝血酶注入微导管,在导管内制备血凝块,然后将血凝块注入颈总动脉,阻塞MCA,诱导产生不同体积的大脑缺血性损伤。这种方法不仅使外科手术步骤更为简便,而且与临床局灶性脑缺血更为接近。因为临床上大多数患者在单纯脑中风事件中很少有大脑血栓栓塞伴两侧颈总动脉阻塞。这种栓塞性脑梗死模型成功率高,手术创伤较小,但也存在不能控制再通、对侧亦可能受累以及可能导致外源物质引起的炎症反应等缺点。凝块状血栓栓子技术,用大脑中动脉中血小板自然形成的凝块或者中
13、动脉中凝血酶形成的凝块可直接模拟人体中凝块诱导的脑缺血。但由于栓子的随机性,无法预测栓塞的部位和大小,侧支循环的影响使组织缺血程度不一,不利于神经症状观察和组织定量分析。4 制备脑缺血动物模型注意事项及观察指标选择术前应对实验者进行培训,通过动物手术测试和动物伦理委员会后方可进行实验手术,包括如何饲养、管理动物;如何操作动物;如何减少动物的数量,如何减少动物的疼痛,如何将动物进行安乐死等。注意动物饲养室、观察室的标准化。手术前12h动物禁食,不禁水。在实验时,麻醉措施的选择和呼吸机的应用亦极为重要;同时应维持生理指标,如体温、系统血压、血糖和血气的正常水平。由于麻醉剂、pH、血气和血压可影响实
14、验性脑缺血的病理生理过程,因此,选择麻醉剂和观察生理指标时要特别注意。Zausinger等18观察了不同麻醉方法,包括腹腔内注射水合氯醛、自主呼吸下通过面罩给予氟烷和气管插管机械通气下给予氟烷,对维持SD大鼠生理指标和脑缺血后病理结果的影响,发现除气管插管机械通气下给予氟烷麻醉方法外,其它两种麻醉方法均可引起血气水平波动较大、血碳酸过多症、乳酸中毒和低血压;同时,脑缺血后动物死亡率较高,梗死体积明显增大。Theodorsson等19观察到通过气管插管和氟烷混合气体麻醉可明显减少实验大鼠的死亡率。因此,在利用小动物进行脑缺血研究应通过气管插管机械通气下给予麻醉。应建立标准化的手术过程,同时手术的
15、时间应尽量相同,即每天的同一时间进行手术。动物分组应以随机分组为原则;同时建立排除实验动物的标准。应采取多指标相互配合的原则。在体观察,不需要处死动物的指标,包括神经行为学评价,如运动、感觉、视觉和记忆功能等;电生理学检查,如脑电图、CBF和诱发电位等;神经生化检查,如脑脊液和血液中神经生化的改变等;神经影像学检查,如头部CT,MRI,MRA和功能MRI等。此类指标与临床患者选择观察指标极为接近,为今后临床应用提供了重要的参考价值。凡涉及人为评价指标时,如神经行为学评价,均应采取双盲检测原则。组织病理学及细胞、分子生物学指标,包括梗死面积或体积的测定;神经元、神经胶质细胞的病理变化;原位基因、蛋白表达的变化等来探讨脑缺血后神经细胞病理变化,为防止脑缺血后神经细胞损伤提供理论依据。5小结研究制作与人类脑血栓接近的脑血栓动物模型,将极大地促进脑血栓病理生理机制及治疗方法的研究。随着实验动物科学的不断发展,对脑缺血动物模型从动物的选择、模型的分类及制备方法等角度进行了多方面的探索。核心是强调缺血损伤的可控性和重现性,同时严格控制各种干扰因素,尽量避免其对实验结果的影响。总体发展趋势一是基础研究中的动物小型化,基于简便廉验的考虑,主要以啮齿类尤其是大鼠为主,近年来由于转基因小鼠的出现,也需要对小鼠的各种脑缺血模型进行研究；另一趋势是在基础研究到临床应用研究的过渡中,基于最大
