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1、沙棘抗虫性机制和分子育种研究进程分析沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科沙棘属落叶灌木或小乔木,是荒漠化防治和水土保持的重要生态、经济树种,在亚欧大陆分布广泛,一般存在于温带、寒温带等地区,还有一些亚热带高山区,在北美地区引种栽培也进行了实验观察1。我国沙棘资源比较丰富,遍及西南、西北、华北和东北等区域。沙棘果实富含维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸等多种生物活性物质,可以增强人体免疫及抗肿瘤等机能2,3。沙棘也具有较好的经济效益,其果实具有丰富的营养,作为食品原料广泛应用,还具有抗氧化等功效,广泛应用于保健品和化妆品中。目前,沙棘在我国已经发展成为一种重要生态经济型树种。沙
2、棘木蠹蛾(Eogystiahippophaecolus)、红缘天牛(AsiashalodendriPalla)、沙棘绕实蝇和沙棘象鼻虫(Elaeidobiuskamerunicus)是危害沙棘的主要害虫。其中,沙棘木蠹蛾是严重危害沙棘林的重大钻蛀性害虫。辽宁省建平县曾有1530hm2沙棘林,是世界上规模较大的人工沙棘林之一,但由于干旱、虫害等生物非生物胁迫等原因,给这个人工沙棘林带来巨大的破坏,同时也影响了相关的沙棘产业4。红缘天牛属天牛科,一年一代,跨越两个年度,其幼虫蛀食长势较弱的树干,成虫取食沙棘嫩叶及嫩枝5。沙棘绕实蝇是危害沙棘果实的主要害虫6,7,自1985年在辽宁省建平县首次发生危
3、害以来8,先后在内蒙古巴彦淖尔和新疆阿勒泰地区的沙棘林中暴发成灾,导致沙棘果实几近绝收,对相关的食品和药用加工企业造成了巨大的经济损失。沙棘象鼻虫也是危害果实的主要害虫,其主要通过取食沙棘幼果的种仁(而非果汁)获取营养。取食时,成虫以喙管穿入果皮,并以喙管插入点为中心,每粒果实只取食一次。每头成虫每天取食49粒果实9。上述害虫大发生时,均给沙棘产业造成巨大的经济损失。目前,林木抗虫机制及通过基因工程培育抗虫新品种是抗虫性研究的主要方向,而植物抗虫基因的挖掘及其在林木分子育种中的应用更是研究的热点。鉴于此,本文详述了沙棘主要害虫的抗虫性机制及分子育种研究展开详述,并提出相关抗虫基因工程、抗虫分子
4、机制及展望,以期为我国沙棘抗虫性研究提供一定的理论基础,并为抗虫沙棘分子育种改良与应用提供科学依据。1、沙棘的抗虫机制林木与昆虫长期互作,协同进化,形成了组成型和诱导型两种防御性机制。组成型防御性机制是由遗传因素影响决定的,植物会形成一种物理或化学因子,通过防止害虫取食达到保护植株的效果;诱导型防御性机制是由病原菌侵染或是机械损伤等诱导产生的免疫应答反应10。1.1组成型抗虫防御组成型防御是植物本身具有的,分为物理组成型抗虫防御和化学物质组成型抗虫防御,受外界因素影响较小。1.1.1物理组成型抗虫防御物理防御是指林木在长期进化过程中形成了多种防御害虫入侵的外部形态特征和内部组织结构,形成物理防
5、御系统来阻止害虫对沙棘果实的伤害行为11。如针叶树筛管丝团中混有的草酸钙晶体也可有效抵抗树皮甲虫12;柳蓝叶甲幼虫更易取食被去除绒毛的柳树嫩叶13;美国西部白松(Pinusbungeana)外皮层含有较多的树脂道,对沙棘象鼻虫具有一定的抗性14;奥利维尔甲虫的幼虫只能以桉树比较幼嫩的叶片作为食物15。物理防御机制是一些大型乔木和裸子植物的常见防御类型,但在胡颓子科沙棘属落叶性灌木的相关研究报道较少,赵延霞等16分析了6个沙棘亚种(品种和杂交种)根、茎和叶的组织结构特征及其与沙棘木蠹蛾抗性的关系,明确了沙棘叶背、叶面表面皮毛与沙棘抗虫性之间的关系。本课题组前期通过电镜扫描发现,不同抗、感沙棘植株
6、的叶片表皮,果皮以及茎的表面均分布着大量的鳞片状毛状体。其中在抗虫植株的表皮组织中毛状体分布密集,且在叶片下表皮和果皮中有重叠现象;而敏感植株表皮中的毛状体相对稀疏(图1)。进一步对沙棘绕实蝇的产卵选择性进行了测定,发现在敏感植株叶片、茎和果实上的产卵数量均高于抗虫植株17,表明绕实蝇成虫偏向于选择毛状体分布少的沙棘作为主要产卵寄主。由此推测,毛状体的分布密度是影响沙棘绕实蝇产卵选择性差异的重要因素,即沙棘表皮毛状体与抗虫性密切相关,沙棘可通过增加毛状体分布密度来进行物理防御。图1不同抗、感无性系毛状体分布密度差异161.1.2化学物质组成型抗虫防御化学物质组成型防御是植物利用本身固有的对害虫
7、具有抗性的化学物质实现抗虫功能。这些化学物质主要分为两类:一类主要有核酸、蛋白质、糖类和脂类等初级营养物质。如白桦(Betulaplatyphyll)随着昆虫的生长,存在于叶片中的两种糖含量会降低18;毛白杨(Populustomentosa)抗虫性受到无性系树皮内总糖含量的影响,含量高的时候毛白杨抗虫性较差19;木质部碳水化合物含量较低有利于幼虫取食20;脂肪酸类物质可通过渗透和堵塞白纹伊蚊呼吸道并覆盖呼吸细胞表面,造成呼吸系统细胞膜破坏对昆虫达到致死作用21。另一类主要是植物的次生代谢物,为了应对植物遇到的生物胁迫与非生物胁迫,会产生萜烯类、酚类和含氮化合物,这些物质的合成和分布具有特异性
8、22。综上,物理与化学防御的共同作用是植物最常见的基础防御。基于此,可从沙棘物理、化学物质等组成型防御角度对沙棘抗虫性机制及开发利用深入开展相关工作。1.2诱导型抗虫防御诱导型防御是树木受到侵害时,通过激发基因调控表达改变自身的理化性质来达到防御目的23。诱导型防御系统具有保守、复杂、精密的特点,并具有持续性、传递性等特点。这个系统会让植物自身产生大量的次生代谢产物以及防御蛋白,以此形成一个复杂的防御体系,当昆虫取食时,植物与昆虫进行接触互作,启动防御系统来应对昆虫摄食带来的病原菌并有效抵御害虫侵害24。林木的诱导型防御主要包括可诱导的化学防御、蛋白防御和生态防御等类型18。1.2.1化学物质
9、诱导型抗虫防御化学物质诱导防御是植物的主要防御方式之一,受到昆虫侵害时植物会产生低分子量酚类、萜类及生物碱类物质,这些物质具有抗菌性和毒性,并抑制摄食昆虫的消化吸收繁殖等生理功能。有研究发现,拥有抗虫基因的白云杉植株被云杉蚜虫取食后,酚类化合物pungenol和piceol合成量显著增加,使昆虫的取食量受到显著影响,有效保护植物自身25。1.2.2蛋白抗虫防御蛋白防御是一个复杂的系统,在这整个防御网络中主要涉及氧化水解酶和蛋白抑制剂,主要功能是抗菌,抑制幼虫生长和昆虫的营养吸收。PR-3蛋白家族具有抑制昆虫生长的作用,通过破坏真菌细胞壁及细胞膜来完成,而PR-6蛋白家族则被发现具有抑制昆虫营养
10、吸收的作用,是一些昆虫的消化酶抑制剂26。除此之外,多酚氧化酶还有减少昆虫吸收氨基酸的作用,抑制昆虫对植物营养摄取消化,作用机制是通过氧化被取食植物种的酚类物质成为醌类化合物,醌类化合物再与昆虫肠道蛋白交联达到目的27。1.2.3生态抗虫防御生态防御主要是通过“宿主-昆虫-天敌”的取食关系来实现的。如北美香柏(Thujaoccidentalis)根部受到黑象甲(CosmopolitessordidusGermar)幼虫侵害时,会释放乙酸叶醇酯来吸引其天敌杆线虫(Ceanorhabditiselegans)28。植物与植食性昆虫在长期的相互过程中形成了多种防御机制,进而快速适应环境。上述防御机制
11、在其他林木抗虫功能研究中已有广泛报道,这为进一步深入研究各种诱导防御机制参与沙棘抗虫的调控过程提供了重要的理论依据。本课题组前期对抗、感沙棘植株抗绕实蝇研究中发现,抗、感沙棘无性系中分别含有醛类、酯类、醇类、酸类、酚类和甲基硫等多种化学防御物质。其中,抗虫沙棘植株中酯类物质含量明显低于敏感植株,而醛类物质含量明显高于敏感植株,这些化学物质直接或间接参与了沙棘抵御绕实蝇的防卫。同时,在绕实蝇产卵盛期,抗虫沙棘无性系内可溶性蛋白和脯氨酸等防御蛋白含量均显著高于与敏感无性系,表明沙棘植株可以通过产生化学防御物质来抵御绕实蝇的危害17。1.3激素相关信号通路介导的植株抗虫机制昆虫从植物中摄取营养物质有
12、多种手段,同时植物应对昆虫的侵害也进化出了多种防御机制,如可通过转录因子调控茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和乙烯(ET)等信号途径29参与植株的防御防卫。植物WRKY转录因子既可通过参与JA、ET和SA信号代谢途径,也可作用于下游靶基因来提高植株的抗逆性30,31,32,33。如火龙果(Hylocereuspolyrhizus)HpWRKY44可通过调控下游靶基因CYP450-like1的表达,从而表现出对不同逆境的应答反应33;陆地棉(Ghossypiumhirsutum)GhWRKY40基因通过调控MPK-WRKY-茉莉酸(JA)或ET信号通路来提高植株对白粉虱(Trialeurodesv
13、aporariorum)的抗性34;水稻(Oryzasativa)OsWRKY24/70/53/45通过影响乙烯(ET)信号途径来参与调控抗褐飞虱(Nilaparvatalugens)反应35,36,37。还有研究发现,大豆(Glycinemax)WRKY家族成员受水杨酸(SA)信号通路诱导提高了植株抗大豆胞囊线虫的能力38。尽管国内外学者在WRKY转录因子信号通路等方面开展了一些研究,但多集中在模式植物拟南芥、水稻及经济作物大豆和棉花中,有关胡颓子科植物WRKY成员分子特征及介导毛状体分布密度参与抗虫的分子机制,迄今未见有相关论文发表。本课题组利用沙棘转录数据,获得了沙棘HrWRKY基因家族
14、成员48个,其中HrWRKY44与拟南芥AtWRKY44有同源性,据此推测沙棘HrWRKY44可能通过某种信号途径参与了植株毛状体的形态建成,进而提高了植株的抗虫性。2、沙棘抗虫性分子育种研究目前,林木抗虫育种主要是利用抗性资源进行常规育种,但由于林木抗虫的复杂性以及林木、昆虫互作机制研究的局限性,林木抗虫育种一直是林业生产上的重大科学问题。近年来分子育种技术的快速发展为林木抗虫育种提供了有效的探索途径,各研究学者对抗虫基因进行了深入研究,发现并挖掘植物中的各种抗虫基因病,深入研究植物体内的各种抗虫机制,为林木抗虫基因工程育种提供了大量资料。目前已对多种树种的分子抗虫机制进行了深入研究,通过转
15、基因获得抗性植株,其中很多研究成果已经投入到了生产应用中39,40。与上述林木相比,有关沙棘抗虫相关的常规育种或分子育种研究鲜见报道。本课题组在中国林业科学研究院沙漠林业实验中心经过数年的调查,发现了少量的高抗绕实蝇沙棘植株,开展了生理水平、挥发性物质和次生代谢物质等方面的研究,发现一些次生代谢物质不同程度参与了植株的抗虫性17。这些具有抗虫优良性状的植株为深入研究沙棘抗虫的分子机制提供了重要的种质资源。2.1分子标记辅助育种种质资源的鉴定是林木育种的重要保障,同时为林业科研和生产也提供很大帮助。传统的形态学和生化鉴定方法已无法满足科研、生产需要,随着深入研究以及科技发展,发现了分子标记技术,
16、从分子的角度对林木种质资源进行鉴定和纯度分析研究。如Fossati41通过AFLP分子标记技术,将形态上不能区分的天然欧洲山杨、银白杨、银灰杨的杂种区进行区分。Ruan和Li42用RAPD分析了来自中国、俄罗斯、蒙古的14个不同沙棘品种的遗传关系。沙棘在品种筛选过程中已运用了分子标记辅助育种技术,但还未运用到沙棘抗虫性研究中。由此可见,寻找与经济性状紧密连锁的分子标记,为沙棘分子标记辅助育种提供可靠的科学依据,对培育沙棘抗虫品种具有重大帮助。2.2转基因抗虫育种转基因作为重要的生物技术,在林木抗虫育种工作中广泛应用。通过DNA重组技术,将一些外源带有抗性的目的基因导入到林木染色体中,从而使外源抗虫基因表达,表现出抗虫性。目前研究表明,林木的抗虫基因主要来源是微生物源、植
