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1、生物 选修3现代生物科技专题目 录专题1 基因工程专题2 细胞工程专题3 胚胎工程专题4 生物技术的安全性和伦理问题专题5 生态工程专题1 基因工程技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现 5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物问世 7.PCR技术的发明 基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和生物产品。一、基因工程
2、的概念基因工程的别别名操作环环境操作对对象操作水平基本过过程实质实质结结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平定向地改造生物的性状，获得人类所需要的品种。剪切 拼接 导入 表达基因重组基本工具：限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”二、 DNA重组技术的基本工具黏性末端黏性末端黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏
3、性末端。识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。4000种。 （1）来源： （2）种类： （3）作用：（4）结果： 形成两种末端黏性末端平末端1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”（小结） 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。 是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了? 实际还不够,还需要DNA连
4、接酶进行连接。思考题：1、种类：2、作用部位：Ecoli DNA连接酶（黏性末端）T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端）磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。2、 DNA连接酶“分子缝合针”3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”（1）运载体的作用u作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。u利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。（随载体的复制而复制）（2）作为运载体必须具备的条件u 能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。u 具有一个或多个限制
5、酶切点，以便与外源基因连接。u 具有某些标记基因，便于进行筛选。u 必需是安全的，不会对受体 细胞有害。u 大小应适合，便于提取和操作（3）常用的运载体 3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”u细菌细胞质的质粒u噬菌体的衍生物u动植物病毒注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。质粒：质粒： 质粒是染色体外能够进行质粒是染色体外能够进行自主复制自主复制的遗的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的中核区外的DNADNA分子。现在习惯上用来专分子。现在习惯上用来专指细菌、指细菌、酵母菌酵母菌和放线菌等生物中和放线菌等生物中核以外的核以外的DN
6、ADNA分子分子。 质粒质粒是基因工程是基因工程最常用最常用的的运载体运载体。 绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状DNADNA分子分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。菌中有多个。3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车” 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒是基因工程最常用的运载体。（补充知识）基因的结构1、原
7、核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。原核细胞的基因结构能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质 编码区非编码区不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子2、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 启动
8、子终止子编码区上游 编码区下游 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子： 外显子： 真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子 启动子与起始密码 启启 动动动动 子子 起起 始始 密密 码码码码 位位 置置 DNADNA上基因的非上基因的非编码编码编码编码 区区，在，在编码编码编码编码 区上游段（区上游段（左左侧侧侧侧）位于位于mRNAmRNA上的开始上的开始位置的密位置的密码码码码 （转转转转录产录产录产录产 物）物）
9、 功功 能能 转录时转录时转录时转录时 与与RNARNA聚合聚合酶酶结结结结合，合，对转录对转录对转录对转录 mRNAmRNA起起调调调调控作用。控作用。是翻是翻译译译译的开始，是的开始，是肽链肽链肽链肽链 延伸的第一个延伸的第一个氨基酸的位点。氨基酸的位点。原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码二、基因工程基本操作的四个步骤目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定（一）
10、目的基因的获取1、目的基因主要是指_人们所需要的特定基因2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成未知序列已知序列（1）从基因文库中获取目的基因：基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)比较 概念：PCR全称为_，是在生物_复制_的核酸合
11、成技术 条件：_、 _、_ 、 _ 等 前提条件： 。原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）结果：多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(2)利用PCR技术扩增目的基因双链的解开过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链（3）人工合成反转录法：
12、以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)（3）人工合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_
13、 _。二、基因表达载体的构建 核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同4.一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有、以及等。启动子终止子标记基因质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）限制酶处理同一种4.过程:（二）基因表达载体的构建 核心5.基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因（二）基因表达载体的构建 核心启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能
14、驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来(三)将目的基因导入受体细胞转化 方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达(三)将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞的方法： 农杆菌转化法（1）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法农杆菌介绍:Ti质粒上有T-DNA,称为可转移的DNA,它可转移到受体细胞,
15、并整合到受体细胞染色体DNA上.2、将目的基因导入动物细胞(受精卵)显微注射法 -世界上第一例“超级小鼠”的成功设备:显微注射仪3、将目的基因导入微生物细胞(三)将目的基因导入受体细胞原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等过程：用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。四环素四环素抗性
16、基因抗性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因(四)目的基因的检测与鉴定 检查是否成功通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 所以要对受体细胞作怎样的处理？对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测 怎样进行检测？DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 (四)目的基因的检测与鉴定 检查是否成功检测鉴定检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中方法: DNA分子杂交方法: 分 子 杂 交方法: 抗原抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA
