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1、粪便标本的细菌学检验第八组目的与要求o 掌握粪便标本的方法o 掌握粪便标本的细菌学检验程序与方法Backgroundo 正常人的肠道中栖居大量的不同种类的微生物，组成人类健康极为重要的体内微生态环境参与营养、消化、吸收及清洁肠道，维护健康的作用。o 腹泻因病原菌或病毒在在肠道繁殖引发，引起 腹泻细菌种类多。o 本实验主要介绍疑为沙门菌或志贺菌属感染者 或带菌者的粪便标本（或直肠拭子）中致病菌 的分离和鉴定。 Background粪便标本常见的病原菌：G菌：葡萄球菌属、白色假丝酵母菌、艰难梭菌、结核分枝杆菌、蜡样芽孢杆菌G菌：志贺菌、沙门菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、亲水气单胞菌、类志贺邻单胞
2、菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌 试剂与器材o 菌株：伤寒沙门菌 o 培养基：麦康凯和SS琼脂平板 o 各种生化反应培养液及革兰氏染液等试剂（可参见微生物的自动分析及附录） o 沙门菌多价“O”（A-F组）及单价“O”诊断血清、“H”因子诊断血清 标本的采集o 由于粪便中细菌种类很多，故应根据检查目的的不同选择适宜的培养液或用适当方法处理，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。o 不能认为粪便中细菌含量多，粪便标本的采集就无须无菌操作。粪便标本的采集也应遵循无菌操作的原则。若便器或标本容器不洁而污染了变形杆菌，就可能影响病原菌的分离检出，甚至把污染菌误报，造成误诊。标本的采集o 采样的时期应合适
3、。疑似痢疾患者应在发病初期、用药前采取标本。粪便标本采集时应挑取无尿液污染的有脓血、黏液部分的粪便23g（液状粪便可挑取絮状物），盛于无菌容器内送检。o 在无法获得粪便时，可采用直肠拭子，即用灭菌棉拭子经0.9%氯化钠溶液或增菌培养液湿润后，插入肛门内)45cm处，轻轻转动一圈后取出，插入无菌试管（Cary Blair系统运送管）或保存液中送检；o 疑似伤寒患者应在发病23周内采集粪便标本。标本的采集o 在无法获得粪便时，可采用直肠拭子，即用灭菌棉拭子经0.9%氯化钠溶液或增菌培养液湿润后，插入肛门内)45cm处，轻轻转动一圈后取出，插入无菌试管（Cary Blair，卡布系统运送管）或保存液
4、中送检；应采集可疑粪便，如立即患者粘液脓血便、霍乱患者的米泔水样便等。以为换乱患者，硬质碱性蛋白胨水中。o 除婴幼儿外，不推荐用棉拭子做常规病原菌培养。o 粪便标本如不能立即送检，可将标本放入甘油盐水保存液中，或保存于冰箱内（勿超过2小时）。粪便标本的细菌学检验程序粪便标本或肛拭子道标本涂片增菌培养直接分离报告革兰染色；动力学观察与制动试验（KIA、MIU）初步报告需氧培养GN增菌液或亚硒酸增菌液碱性蛋白胨TCBS平板或其它碱性平板分离SS平板MAC平板EMB平板副溶血性弧菌选择平板菌落形态生化反应菌落形态、生化反应、抗血清凝集药敏菌落形态、生化反应、抗血清凝集药敏步骤与方法o革兰氏染色o志贺
5、菌与沙门菌：急性腹泻患者的粪便标本划线接种于SS平板和MAC平板。o慢性腹泻患者志贺菌或携带者应接种GN增菌液，沙门菌接种亚硒酸盐增菌液，再转种SS平板与MAC平板，观察小的、透明或半透明、无色或浅黄色的可以菌落生长，有时SS平板可见中心黑色菌落（H2S）。o挑选三个可疑菌落分别接种三支KIA、MIU培养基，观察结果。o挑取菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态、排列。o采用伤寒沙门菌诊断血清进行血清学鉴定。步骤与方法o生化反应鉴定第2日观察平板上有无可疑菌落，用接种针于上述平板中挑取单个可疑菌落（无色、半透明、光滑、较小）23个，分别接种至23管双糖培养液内，置37培养1824h。第3日观察细菌生
6、长情况，根据表102初步鉴定细菌种类，然后取双糖培养液上 的菌落进行系列生化鉴定。 o表 不同肠道细菌在双糖培养液培养结果（教学实验模拟标本的结果） 序号 上层（乳糖） 下层（葡萄糖） 动力 可能结果 o 1 + + 有 大肠埃希菌 o 2 + 有 伤寒沙门菌 o 3 + 无 痢疾志贺菌 步骤与方法o 血清学最终鉴定根据双糖培养液及系列生化反应结果判断，最后利用血清学实验对细菌进行最后的确定。 o 如果初步鉴定结果为沙门菌属，则取双糖培养液斜面上菌苔与沙门菌多价“O”（A-F组）诊断血清作玻片凝集实验，如凝集即为沙门菌属，然后分别与A-F组的单价“O”诊断血清作玻片凝集实验定组，最后以H因子诊
7、断血清作玻片凝集实验以定型（种），必要时可用因子诊断血清定型。 o 如果根据双糖培养液及系列生化反应结果判断，初步鉴定结果为志贺菌属，则取菌苔与志贺菌属多价诊断血清作玻片凝集实验以定组，必要时可用因子诊断血清定种或型。步骤与方法o 若为较典型的沙门菌生化反应，但与A-F组多价“O”诊断血清又不发生凝集反应，应考虑可能为有VI抗原的沙门菌，可将菌制成悬液以100加热30分钟以除去VI抗原后，再做血清学鉴定。o 如为较典型的志贺菌生化反应又不与其多价诊断血清发生凝集，则可用同样方法加热1001小时以破坏其K抗原，再做玻片凝集反应鉴定之。o 在细菌的血清鉴定中，最常使用的方法是凝集反应，其基本原理是
8、细菌为颗粒性抗原，当与相应的抗体混合时，在一定浓度的电解质条件下，可出现肉眼可见的凝集现象。 步骤与方法o 取一洁净载玻片，用记号笔划两个11.5cm的圆圈。 o 取1：5或1：10诊断血清一接种环置于玻片左侧圈内，在右侧圈内放一接种环0.9%氯化钠作为对照。如天气炎热，环境温度高，则应适当多取血清及0.9%氯化钠，以防试剂短时间内干涸，影响结果的观察。 o 用接种环取待鉴定的新鲜细菌少许，分别研磨乳化于诊断血清及0.9%氯化钠内使之均匀混合。旋转摇动玻片数次，13分钟后观察结果。 o 按上述操作方法，依次分别做A-E多价血清定属，特异性O因子血清定群，H因子血清定型（或种）。 结果o 阴性：
9、对照侧及实验侧均匀混浊不出现凝集。 o 阳性：盐水对照侧呈现均匀混浊，实验侧明显凝集。 o 自凝：对照侧及实验侧均出现凝集。 步骤与方法o 取一洁净载玻片，用记号笔划两个11.5cm的圆圈。 o 取1：5或1：10诊断血清一接种环置于玻片左侧圈内，在右侧圈内放一接种环0.9%氯化钠作为对照。如天气炎热，环境温度高，则应适当多取血清及0.9%氯化钠，以防试剂短时间内干涸，影响结果的观察。 o 用接种环取待鉴定的新鲜细菌少许，分别研磨乳化于诊断血清及0.9%氯化钠内使之均匀混合。旋转摇动玻片数次，13分钟后观察结果。 o 按上述操作方法，依次分别做A-E多价血清定属，特异性O因子血清定群，H因子血
10、清定型（或种）见p119。 注意事项o在细菌的血清鉴定中，最常使用的方法是凝集反应，其基本原理是细菌为颗粒性抗原，当与相应的抗体混合时，在一定浓度的电解质条件下，可出现肉眼可见的凝集现象。 玻片法凝集实验是用诊断血清在玻片上与待测细菌相混合，在电解质 存在下，若出现肉眼可见的凝集小块即为阳性，表示该菌为所用抗体的相应细菌。此法是一种定性实验，方法简便快速，特异性强。可用于鉴定菌种及菌型。用于鉴定细菌的诊断血清有以下几种： o多价诊断血清：即混合诊断血清。该血清含有两种（或型）以上细菌的相应抗体。一般用于细菌定群或初步分型。 o单价诊断血清仅含一种（或型）细菌的相应抗体。可用于细菌的定种（或型）。 o因子诊断血清细菌含有多种抗原成分，而且不同菌群细菌之间可有共同的抗原成分。因此，通过凝集吸收实验，将抗血清中的共同抗体除掉，仅含一种特异性抗体的诊断血清称为因子血清。可用于细菌分型。
