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1、 热带作物顽拗型种子保存研究进展 田新民+李洪立+何云+洪青梅+胡文斌+李琼摘 要 本文概述顽拗型种子的生理特性和目前主要保存技术，从作物种类和研究内容方面详细阐述了热带作物顽拗型种子保存的研究进展，就存在的问题进行深入分析总结，并对未来的研究重点作出展望。关键词 热带作物 ；顽拗型种子 ；保存分类号 S339.3+2Research Progress on Recalcitrant Seeds Storage of Tropical CropsTIAN Xinmin LI Hongli HE Yun HONG Qingmei HU Wenbin LI Qiong（Tropical Crops
2、 Genetic Resources Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China）Abstract The physiological characters of recalcitrant seeds and its current preservation techniques were summarized. The research progress of seed storage for tropical crops， including the crop types and research focus， were
3、 elucidated in detail. Finally， existing problems for the storage recalcitrant seeds were discussed and the future research focus is prospected.Keywords tropical crops ； recalcitrant seeds ； storage种质资源主要包括种子、种苗和各种离体材料等，其中种子是种质资源最主要的组成部分，携带父母本各一半的遗传信息，并且易储运，不易腐烂，占用空间小，繁殖再生能力强，是遗传育种和作物栽培最直接的原始材料。因此，种
4、子保存是最经济、安全和高效的种质资源保存方式，可以节约大量的人力和物力。近年来，全球植物物种多样性迅速减少，拯救和保存植物物种资源被世界各国所高度重视1，发达国家陆续建立了一批现代化的种质保存库，中国也建立了多个专业的种质保存库，如建立在北京的国家农作物种质保存中心和昆明的西南野生生物种质资源库。近年来，国家重点投资建设的种子保存大项目，经过几年的努力，成功抢救和保存了国内大量的珍贵植物种质资源。保存的物种不乏一些重要作物、珍贵濒危和极端环境物种资源，但极少涉及热带作物顽拗型种子资源。热带作物主要包括天然橡胶、木薯、油棕等作物，香蕉、荔枝、芒果等热带水果以及咖啡、桂皮、八角等香（饮）料，是重要
5、的国家战略资源和日常消费品。鉴于热带作物对国民经济发展的重要性，其种质资源的保护尤为重要。中国目前已收集和保存的热带作物种质资源达4万多份2-3，包括橡胶树、木薯、热带果树、热带牧草以及热带香辛饮料等作物，主要以种质圃的形式保存，占用土地面积大，且易受病虫害和自然灾害（台风、寒潮等）的破坏，更新和维护成本高，种质的遗传多样性也受到了很大的限制。因此，热带作物种子的长期、安全保存对热带作物种质资源的保护和利用至关重要，与热带作物产业的发展息息相关。本文就热带作物顽拗型种子特性及其主要保存方法和技术、近年来热带作物种子保存的研究进展以及存在的问题进行详细的论述，并就未来的研究重点作出了展望。1 顽
6、拗型种子特性种子类型、种子质量、种皮的完整性、种子含水量以及保存环境是影响种子寿命的5大因素，其中种子类型是最重要的因素。根据种子的生理特点，种子可分为正常型种子（orthodox seed）、中间型种子（Intermediate seed）和顽拗型种子（recalcitrate seed）4-5。75%80%的被子植物种子是正常型种子6-7，能在-20的低温保存很长一段时间；5%10%的被子植物种子产生顽拗型种子8，在热带地区大约47%的物种种子为顽拗型种子7，9-11。10%15%的被子植物种子为中间型种子，有一定的耐脱水能力，在低温条件下可以存活一定时间12。顽拗型种子与正常型种子的不同
7、在于，顽拗型种子脱离母株时不经过成熟脱水期，其含水量相对较高（20%60%），且对脱水及低温高度敏感，采收后不久便可自动进入萌发状态，一旦脱水（即使含水量仍很高）即影响其萌发，导致其生活力的迅速丧失，温度过高或过低也会严重影响其活力，因此不耐贮存，寿命很短，主要包括一些水生植物、热带植物以及小部分温带植物的种子4。此外，同属内的物种间其种子储藏特性也有一定的差异（如咖啡属和柑橘属），种子耐干燥的能力因物种而异，和其在分类学上的亲缘关系没有必然的关联6，13-14。多数顽拗型种子含水量降至15%20%时即受到伤害，并且对0以上的低温敏感。Farrant等15根据忍耐水分亏缺能力的不同，又将顽拗型
8、种子分为低度、中等和高度3类。低度顽拗型种子能忍受一定的水分丧失和较低的温度，一般分布于亚热带和温带地区，如壳斗科栎属的板栗、棕榈科的丝葵等；中度顽拗型种子能忍受中等程度的脱水和稍高的温度，如可可和橡胶树；高度顽拗型种子通常分布于热带雨林湿地，其脱落酸（abscisic acid，ABA）含量低，缺乏类脱水素蛋白，仅能忍受少量的水分丧失，而且对温度高度敏感。由于顽拗型种子对低温脱水的敏感性，给长期贮藏带来了极大困难，大多数顽拗型种子又具有极高的经济价值和保存价值，因此对顽拗型种子保存的研究意义显得尤为重要。热带作物种子除去木薯（正常型种子）和极个别作物外16-18，大多属于顽拗型种子，其中热带
9、果树种子全部为顽拗型种子。endprint关于顽拗型种子不耐脱水贮藏的机理，迄今仍没有一致的令人满意的结论。通常认为，顽拗型种子脱水伤害的3个可能位点是：膜、酶和染色体19。一些顽拗型种子在脱水时，溶质渗漏大量增加，表明膜的完整性受到破坏20-21。关于顽拗型种子脱水时的超微结构变化已有一些报道。坡垒、青皮种子脱水后，导致内质网上核糖体减少、质体中淀粉消失及细胞空泡化等。Berjak等22也发现，Landophia kirkii种子在硅胶上干燥15 d后，其胚轴细胞发生显著变化，种子死亡时原生质解体。2 顽拗型种子主要保存方法和技术2.1 短期保存根据顽拗型种子不耐脱水及低温的生理特性，在不影
10、响种子活力的前提下，应尽可能降低种子贮藏温度及含水量，减少种子贮藏过程中的代谢活动，并添加杀菌剂保存种子，达到短期贮存的目的。如黄皮种子自然条件下的寿命只有10多天，但将生理成熟期的新鲜黄皮种子部分脱水，加入4%6%的百菌清，在15的温度条件下装于塑料袋中贮藏，60 d后仍可保持90%的发芽率23；将橡胶树种子先进行部分脱水使种皮趋于风干后，置于能换气的塑料袋中，于15下贮存85 d后仍保持90%的发芽率24。这种方法只能有限地延长种子的寿命，且贮藏过程中种子活力仍不断下降，达不到长期保存的目的。2.2 超低温保存顽拗型种子在适度的水分状态和超低温状态下，不仅能维持种子活力，保持组织和细胞形态
11、的完整性和遗传稳定性，防止物种衰老，还能使种质材料免受病虫的侵害。在超低温条件下，细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止，最大限度地抑制了其生理代谢强度。从理论上讲，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会发生遗传变异和性状的改变25。但是，如果生物机体细胞内的水在降温过程中发生结冰，造成细胞结构的损伤和破坏，最终会导致细胞死亡。因此，超低温保存的关键，是避免降温过程中细胞内结冰。一般来说，随着温度的降低，细胞外溶液先于细胞内含物结冰，造成细胞内外的压力差，只要降温速率不超过脱水速度，细胞内的水就不断向外渗透和扩散，细胞原生质溶液逐渐浓缩，细胞内含物的冰点也在降低，能有效地遏制细胞内溶液结冰。但
12、是，细胞的过度失水可能造成细胞内有害物质的积累（如自由基），使得蛋白质和酶的结构发生改变，从而破坏膜的完整性25。在降温冰冻过程中，避免细胞内结冰和过度失水是超低温保存技术中的核心问题。研究表明，控制冰冻速度和添加冰冻保护剂对防止细胞内结冰尤为重要26-28。通常情况下用-196的液态氮快速冷冻1，29-31，该技术要求组织快速脱水和制冷，小样品要求有一定的扩散和热传递速度，以防止冰晶形成32-33。一般认为胚是超低温保存的最佳材料，因为胚是植株的雏形，包含绝大部分的遗传信息，体积小，在短时间内脱水而不影响活力，而且与其他材料相比，胚的耐脱水和耐低温能力更强34-39。因此大多数顽拗型种子超低
13、温保存均选用生理成熟期的胚（或胚轴），而且材料越新鲜，效果越理想15，也有采用幼胚作外植体的，如可可幼胚40。另外，添加冷冻保护剂可防止冷冻和脱水过程中结构的破坏，减少胁迫相关的自由基调节的损害22，29-30。3 热带作物顽拗型种子保存研究进展3.1 研究范围和内容目前，在热带作物顽拗型种子保存研究领域，只涉及荔枝、龙眼、橡胶树、油棕、黄皮、芒果、咖啡、胡椒、可可、澳洲坚果、火龙果等作物，研究报道比较多的有荔枝、龙眼、芒果、橡胶树和澳洲坚果等种植面积较大的作物，其研究内容主要集中于种子在不同采收时间、脱皮方法、成熟度等条件下的萌发特性，不同温度和含水量下的种子储藏特性。另外，对可可、椰子、咖
14、啡等作物胚轴还进行了超低温保存的探索。但是，到目前为止，部分热带作物（如腰果、莲雾、杨桃等）种子属性依旧不清楚，其萌发特性和保存条件方面还没有相关研究报道。3.2 研究动态及进展3.2.1 荔枝、龙眼研究结果表明，荔枝和龙眼种子的生长发育早于其果实，当种子成熟时，果实仍未完全成熟，此时种子鲜重已达高峰，发芽率为100%，当果实成熟采收时，种子对部分脱水的忍耐力反而下降，表明种子成熟后在果实中又进入了萌发状态，因而不耐脱水。荔枝和龙眼种子发育早期含水量一直下降，但此时水分总量却不断上升，当种子即将成熟时，水分总量维持在较为恒定的水平，在40%以上（荔枝44.6%，龙眼42.5%）41。在自然脱水
15、过程中，荔枝和龙眼种子的发芽率随含水量下降而降低，至8 d后二者完全丧失发芽能力，其含水量大概维持在18%42。只要种子含水量高于25%，发芽率就不会受到严重影响；但含水量低于25%时，发芽率急剧下降。当含水量降至20%或更低时，如不及时调节干燥环境，种子将不能再萌发。因而，种子萌发率与临界含水量之间存在着显著的正相关。当种子含水量低于20%时，种皮逐渐“硬化”，对水几乎没有透性。Sowa等43通过将麻醉剂（N2O）和氧气（O2）混合使用来延长荔枝和龙眼种子的寿命，荔枝种子在80%N2O和20%O2条件下存储，12周以后仍能保持92%的萌芽率；龙眼种子放在80%N2O和20%O2的混合气体中，
16、7周以后可保持70%的萌芽率。原因可能是N2O对湿润环境下的种子呼吸代谢有抑制作用，可以减慢种子的萌发，同时也能抑制好氧微生物的代谢和生长。麻醉剂N2O和02的混合使用，为人类提供一种贮存顽拗型种子的最新方法和新思路。夏清华等44尝试通过超低温方法进行荔枝和龙眼胚轴的保存，荔枝和龙眼种子离体胚轴的临界含水量分别为30%和23%，低于此值时，其生活力迅速下降，高于临界含水量的龙眼种子离体胚轴，经液氮贮存后无一存活。与种子相比，胚轴对脱水的忍耐力更大，而且龙眼胚轴比荔枝胚轴对部分脱水的忍耐力更大41。3.2.2 橡胶树endprint橡胶树种子是典型的顽拗型种子，在成熟落地后随即萌发，且萌发率极高，达到62.7%，对脱水具有高度的敏感性45-46，在快速和缓慢脱水条件下的种子致死含水量分别为40.3%和48.
