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1、中华圆田螺抗菌肽理化性质及抑癌活性测定杨丽丽I,王斌I,朱化化2,李玉萍I,刘建涛“(1.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌330000；2.瑞莱生物工程有限公司，广东 深圳518000)摘 要：月的筛选中华圆田螺抗菌活性物质，检测其抗肿瘤活性。期去本实验通过注射大肠杆菌免疫 中华圆田螺，收集血淋巴并通过高温处理制成含有抗菌肽的粗提液，测定其抗菌效呆和理化特性。以人体 肺腺癌细胞A549为体外实验模型，通过细MTT实验，研究中华圆田螺抗菌肽对人体肺腺癌细胞A549细 胞的生长抑制作用。结果经过分离得到含有中华圆田螺抗菌肽的粗提液。粗提液抑菌效果明显；具抑菌活 性随着处理温度的升高，处理时间
2、的延长呈现逐步降低的趋势，但仍表现出较好热稳定性；在弱酸性 (pH46)条件下，随着酸性的降低抑菌活性呈现增加的趋势，在中性和碱性(pH712)条件下，随着碱 性的增加抑菌活性不断降低；随着冻融次数的增加，抑菌活性略有变化；通过MTT实验表明，中华圆田 螺抗菌肽对人体肺腺癌细胞A549的牛长抑制作川随着浓度的增加而加强。结论本实验成功筛选到中华圆 田螺抗菌肽，并检测其在体外对人体肺腺癌细胞A549具有抑制生长作用。厶 关键词：抗菌肽；中华圆田螺；抗菌效；，理化特性；抑癌活性Bacteriostatic Effect of Antibacterial Peptide from Cipangopa
3、ludina Cathayensis and the Determinationof Physical and Chemical Properties and Tumor-suppressor ActivityYANG Li-liLWANG BinZHU Hua-hua2,LI Yu-pingLIU Jian-tiao1*(1. College of Life Science, Jiangxi Science and Technology University, Nanchang 330000. Jiangxi, China;2. Reliance Biological Engineering
4、 Limited Company. Shenzhen 518000.Guangdong, China ) Abstract: jObjeeti书e-To screen the antibacterial peptide from the cipangopaludina cathayensis and test its antiproliferative effects Metheds-This study extracts antibacterial peptide preliminary from cipangopaludina cathayensis and determines its
5、antibacterial effects, physical and chemical properties. Ihc human lung adenocarcinoma cell line A549 be used as the model in vitro MTT. mitotic index experiment and clone formation experiment be adopted to study the inhibition effect of antibiotic peptide Resutts-the bacteriostatic effect of the cr
6、ude extraction is obvious; vith the treating temperature increasing treatment time extending, antimicrobial activity reduce gradually, but still show good thermal stability; Under the weak acidity (pH 46)conditions, antibacterial activity tended to increase as the acidity reduces Under the neutral a
7、nd alkaline (pH 7-12) conditions, antibacterial activity reduces as the alkalinity increases; With freezing and thawing times increasing, antibacterial activity changes slightly; crude extraction shows inhibition to human lung adenocarcinoma cell line A549 cells， prolifcratio n.The antibiotic peptid
8、e fromcipangopaludina cathayensis has significanl inhibition effect on human lung adenocarcinoma cell line A549 Key words: antibacterial peptide; cipangopaludina cathayensis; effect of antibiosis; physicochemical property; tumor-suppressor activity抗菌肽是一类免疫效应因子，它在生物机体的先天免疫系统中起到重要的作用山，具有广谱抗菌、 抗寄生虫、抗病毒
9、、抗癌、抗氧化等多种生物学活性。迄今为止，已有2(X)0多种被分离纯化。其抗癌 作用的机理主要包括：细胞杀伤作用.诱导细胞凋亡.影响信号转导、抗肿瘤转移作用等7】。山丁抗菌带格式的：字体颜色：红色 ）批注微软中国編紺您好：按照 目的方法等格式修改了摘耍 需&式的:号体颜色:红色j:带格式的：字体颜色：红色带格式的：字体颜色：红色批注微软中国2:编辑您好：按照 中文摘耍修改了批注微软中国3:編辑您好：文献 更新了|基金项目：江西省教育厅青年科学基金项目（GJJ10242）；江西科技师范人学校级重点项目（KYZ2008Z乙4上 江西科技师范学院大学生创业、科研项目作者简介：杨m（1989-）,女（
10、汉），木科，研究方向：生物工程。冬通信作者肽具有低毒或无毒，对癌细胞-定的特异选择的特点，使得人们越来越关注于抗菌肽的研究。中华员山螺，学名Cipanopaludina cahayensis,俗名山螺、香螺，英文名Mudsnailo属软体动物门、 腹足纲、山螺科、圆山螺属，广泛分布各地，淡水湖泊、水库、稻山、池塘沟渠等，一年四季生产。中 华圆出螺营养丰富且具有一定的药效作用，在本草拾遗中记载：煮食之，利大小便，去腹中结热，冃 下黄，脚气冲上，小腹结硬，小便赤涩，脚手浮肿；生浸取汁饮之，止消渴；碎其肉敷热疮呀。目削对中华圆田螺的研究和资源开发利用主要集中在饲养和营养价值的研究，但对其体内的抗菌肽
11、 的分离、纯化及其抗癌生物活性作用的研究至今未见报道。因此，木研究以中华圆田螺为研究对象，并 对其体内的抗菌肽进行研究。1材料及方法1.1材料与仪器中华圆田螺购白南昌墩子堀市场；人体肺腺癌细胞A549 cel闲大肠杆菌(Escherichia coli) K12D31菌株 木实验室保存；抑酶肽、苯基硫腺，蛋白腺、酵母提取物、琼脂粉购口Sigma公司；NaCl、HC1、NaOH 购自广州化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。生物安全柜：苏州安泰空气技术有限公司；D-37520冷冻离心机：德国Therm。公司；微量移液器： 徳国Eppendorf公司；生化培养箱：上海博讯实业有限公司；蒸汽灭菌器：上海博
12、讯实业有限公司。1.2实验方法1.2.1中华圆田螺的饲养将市场上买来的中华圆田螺用淸水饲养4 d5 do每天换一次晴水。1.2.2抗菌物质粗提液的制备取中华圆螺，用报纸将其沥干。注射入少量大肠杆菌，诱导英产生抗菌肽，8 h后将其尾部螺纹 敲碎，挤压螺口，使血淋巴流入预冷并加有苯基硫腺(20pmol/L)与抑酶肽(20pg/mL)的离心管中。 然后在冰水浴中将螺壳敲碎，用剪刀剪碎螺肉，收集流出的液体。合并两次的液体。将收集到的液体于4 C, 10 0()0r/min,离心30 min,取上清，将上清液放入沸水浴中加热10 min 后，立刻再次放入冰水浴中冷却。将处理后的样品于4C, I0 000
13、/min,离心30 min,取上清液，即得 粗提液环讥1.2.3抑菌活性测定抑菌活性测定的步骤如下：将指示菌转接到新鲜的液体培养基中，剧烈振荡培养至OD6oo=0.40.6, 然后按1 %的比例加入到含1 %琼脂的固体培养基中，充分混匀，再迅速倒入平皿中。待培养基冷却后， 用打孔器在琼脂板上打孔(直径为7mm)o以无菌水与苯基硫腺、抑酶肽作为对照，每孔60uL, 37 C 培养ld2d,抑繭活性用抑菌圈直径表示(抑菌圈直径=总直径一孔直径)，每组实验重复5次心刀。124抗菌物质的理化性质1.2.4.1温度对抗菌物质的抑菌活性影响取粗提液在50、80、100 C下分别处理，50、80. 100
14、*C的处理时间分别为：10、20、30、45、60、 80. 100 mino处理Z后的样品立即于4 C, 10 00() r/min,离心20 min,取上清测定其抗菌活性，每组 实验重复5次。1.2.4.2 pH对抗菌物质的抑菌活性影响用HC1利NaOH将粗提液的pH值分别调为4、5、6、7、8、9、10、11和12,迅速混匀并静置30 min后，4C10 000r/min离心5 min,取上消，测定其抗菌活性，每组实验重复5次。1.2.4.3不同冻融次数对抗菌物质的抑菌活性影响取10() UL粗提液，在-20 r冷冻，25 *C下解冻，冻融次数分别为5、10、15和2()次，分别检测抑
15、菌活性，以0处理次数为对照，每组实验重复5次U叭1.2.5抑癌活性测定选取对数主长期的人体肺腺癌细胞A549细胞，然后用0.25 %嗾蛋白酶消化，后用含10 %FBS的 RPMI1640培养液制成5x10*个细胞/ mL,并接种于96孔板中，每孔100 uL，接种完成后置37 C 5 %CO2 培养箱中培养24 h,吸去上淸。对照组：加入同体积的无添加福寿螺多糖的培养液100 uL；试验组：分+别加入含有终浓度为20、50、100、200 ug/mL的多糖培养液100 uL,每种浓度均4个平行样品，继续 培养4、8、24h后，及时更换新培养液，在每孔加入含5 mg/ml MTP的无Ca2 Mg2+的PBS液20 uL, 37 C继续培养4h,除去上清，每孔加碱化二甲基亚砚150uL, 37 C温育30 min,时不时轻微振荡，完 全溶解后，用酚标仪测定吸光度（A）值（570 nm）按如下公式计算：抑瘤率=（对照组A值一实验组 A值）/对照组A值X100 %2结果及讨论2.1粗提液抑菌效果粗提液抑菌效果，见表1.试液抑菌圈直径/mm粗提液8.9+0.89无菌水与苯基硫腺、抑酶肽混合液0表1粗提液
