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1、聚介酶链反应检测单纯疱疹病毒糖蛋白G ：基因片段聚合酶链反应检测单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段小华皮肤科杂志1999年第6期第32卷短篇论著作者：方险峰白桦宋彪涂裕英单位：510630 T州，中山医科大学第三附属医院皮肤科单纯疱疹病S（HSV）糖蛋口 G（gG）基因位于HSVUS4序列区，是型间差界最大的一个糖蛋口基因，目前对其功 能尚不甚明了，以此作为“靶位点”分型检测临床样木单纯疱疹病毒感染的PCR方法报道亦较少。我们建 立并初步评价了一种可同时分型检测HSVgG基因的PCR方法，现报道如下。一、材料与方法1临床标木：选择我科门诊临床诊断为生殖器疱疹（GH）的病例40例，共收集GH早期皮疹冰
2、疱、脓疱）标木 17份，中晚期皮疹（溃疡、结痂创面）标本23份，泌尿生殖道拭子标本40份。2. HSV培养及鉴定：以Vero细胞分离培养HSV。阳性培养结果以单克隆抗体间接免疫荧光试验予以鉴定（LP10 抗HSVIgG, API抗HSV-IIgG,均由英国剑桥人学Minson教授惠赠）。HSV国际参考株HSV- I F株，HSV 11333株由湖北医科大学病壽研究所提供，并以微量空斑计数法标定病毒滴度。3. HSVgG基因PCR方法：PCR引物设计参照已经公布的HSVDNA序列，通过PCGENE软件比较HSV- I及HSV- II DNA的同源性,选择HSV- I US4序列区4351bp43
3、70bp片段为HSV- I上游引物;HSV- II HindlllL序列区 4707bp4726bp 片段为 HSV- II 游引物;HSV- I US4 序列 4818bp4837bp（或 HSV-II HindlllL 序列区 4903bp4922bp）片段为型共同下游引物。按文献处理临床标木，构建PCR扩增反应体系并进行扩增反应。 温度循环按94C45s 58C45s 72Clmin进行。经2%琼脂糖凝胶电泳判断结果，出现216bp条带为HSV II阳性,出现490bp条带为HSV-I阳性，对临床标本进行检测时以0.75空斑形成单位（pfu）HSV- I F株及 1.25pfuHSV-I
4、I 333株培养液为阳性对照（参见结果部分）。对HSVgG基因PCR法与细胞培养法结果不一致的标木，以常用的HSVDNA聚合酶基因PCR法再次检测。木 文数据分析以SAS软件包进行x 2检验或精确概率法检验。二、结果1引物设计：PCR引物选自gG慕因跨膜区编码区，3条引物G + C含量均在61%左右，以PCROligo软件检 索引物内部无重复序列，无发夹结构形成，引物间无4个以上连续碱基配对，且已知DNA序列无配合。 扩增产物在490bp及216bp处出现明亮带型，未见其它分子量带型出现。以标准病毒液为模板，当HSV-I 及HSV-II量分别低于0.75pfu及1.25pfu时，即无明显扩增产
5、物出现。2.临床标本细胞培养法与HSVgG 因PCR法检测结果：80份临床标本细胞培养法与gG慕因PCR法阳性者 分别为32份(40%)及42份(52.5%),两者差界具有显著性(P=0.005)；生殖器疱疹不同类型标本的阳性检出 率见表1,中晚期皮疹标本HSVgG基因PCR法的阳性检出率显著高于细胞培养法(P=0.033)o 30份细胞培养 法与gG基因PCR法均阳性的标木，29份两法分型结果一致(HSV- I HSVII、HSV- I及HSV- II混合感染分 别为2例、26例及1例)，1份细胞培养法示HSV-I及HSV-II混合感染,但gG基因PCR法示HSV- II单独感 染，经HSV
6、DNA聚合酶基因PCR法再检测仍为HSV-II单独感染。细胞培养法与HSVgG基因PCR法出现14份不一致检测结果，12份gG基因PCR法阳性但细胞培养法阴性， 经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测全部阳性。2份gG基因PCR法假阴性，经HSVDNA聚合酶基因PCR法 再检测1份阳性，1份阴性。表1牛殖器疱疹不同类型标本细胞培养法与gG基因PCR法的阳性检出率比较标木类型标本数细胞培养阳性数()PCR法邛日性数()P值早期皮疹拭了1716(94.1)14(82.4)0.301中晚期皮疹拭了235(21.7)12(52.2) 0.033泌尿生殖道拭了4011(27.5)16(40.0)0.17
7、2注：为gG基因PCR法若以细胞培养法及HSVDNA聚合酶慕因PCR法为“扩大金标准”，则HSVgG基因PCR法的敏感性、特界性、 阳性预测值及阴性预测值分别为95.5%、100%、100%及94.7%。三、讨论近年來流行病学调查发现部分地区牛殖器HSV-I感染呈上升趋势，対牛殖器疱疹的临床诊断只进行HSV-II 检测，势必造成部分病例漏诊。为此我们选择了 HSVgG基因跨膜区编码区，设计了两条型特异性上游引物 及一条型共同下游引物，一次可同时分型扩增检测HSV-I及HSV-II DNAo扩增片段的长度札I差一倍以上， 结果易于判断。对生殖器疱疹标木检测的结果表明，gG基因PCR法不论在总体阳
8、性率还是对生殖器疱疹中 晚期皮疹标本的阳性检出率均显著高于细胞培养法(P值分别为0.005及0.033)；与单克降抗体间接免疫荧光 试验的比较证实其分型结果可靠，并可同时分型检测HSV-I及HSV- II,从而避免了 HSV-I的漏检，具有一 定的临床应用价值。本文发现2份标本gG基因PCR法假阴性，对其细胞培养液再检测均阳性，排除了引物 设计的影响；经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测1例阳性，1例阴性；证实gG基因PCR法假阴性的原因 可能为标本HSV滴度过低，超过了 gG基因PCR法的最低检测极限，尚有待改进。参考文献1白桦，佟菊贞，叶兴东，等生殖器疱疹的诊断及特征探讨.中华皮肤科杂志
9、，1996, 29： 169-171.2伍新尧,罗超泉,杨英浩基因诊断原理与临床第1版.广州：中山大学出版社,1995.3 Piiparinen H, Vaheri V. Genotyping of herpes simplex viruses by polymerase chain reaction. Arch Virol, 1991,119:275.4 Nageswara n A, She n RN, Kinghor n GR, et al. Appare nt in crease in the prevalence of herpes simplex virus type 1 genital infections among women. Genitourin Med, 1994,70:427（收稿：1998-11-18 修冋：1999-02-25）
