研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容要揭示上述动态过程往往需要进行多个样品的同步比较分析.近年来在体内和体外同位素标记基础上用多维液相色谱分离多肽，进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一 Introduction 相对和绝对定量同位素标记( isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ ) 技术是美国应用生物系统公司在 2004 年推出的一项新的体外同位素标记技术.使用该技术可以寻找差异表达蛋白，并分析其蛋白功能，同时可以对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定.如今，iTRAQ 技术已经在蛋白质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用Introduction IntroductioniTRAQ的8种同位素标记试剂由8种(或4种)相对分子质量均为305的等量异位标签分子组成Theory(iTRAQ) 报道基团(reporter group) 113 114 115 116 117 118 119 121 平衡基团(balance group) 192 191 190 189 188 187 186 184 1个相同的反应基团(reactive group ) Theory(iTRAQ)化学标签组成 肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个Lys侧链相连，可标记所有酶解肽段，在其上 8 种报告基团通过平衡基团与反应基团相连 报告基团和平衡基团的平衡分子量都为305，因此改变任一iTRAQ试剂，不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量都完全相同.而在串联质谱中，同重元素标记肽段自所示虚线部分裂解，平衡基团在二级质谱发生中性丢失.信号离子表现为不同质荷比(113121)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息Theory(iTRAQ)Theory(iTRAQ) 生物质谱用于蛋白鉴定的基本原理Theory(MALDI-TOF) 二级质谱用于蛋白鉴定的基本原理Theory(MALDI-TOF) Theory(MALDI-TOF) Theory(MALDI-TOF) Theory(MALDI-TOF) Methods1.还原蛋白和封闭半胱氨酸 每管样品中含蛋白样品5-100 g。
1）每个样品管中加入20 L溶解缓冲液和1 变性剂 （2）漩涡震荡混匀 （3）每个样品管中加入2 L还原试剂 （4）漩涡震荡混匀，短暂离心 （5）在60 水浴中保温1 hr （6）短暂离心 （7）每个样品管中加入1 L半胱氨酸封闭剂 （8）漩涡震荡混匀，短暂离心 （9）室温放置10 min Methods2. 胰酶消化蛋白（1）在每个新的胰酶瓶中加入25 L超纯水溶解胰酶 （2）漩涡震荡使胰酶充分溶解，短暂离心 （3）每个样品管中加入210 L胰酶溶液 （4）漩涡震荡混匀，短暂离心 （5）37 保温过夜（1216 hrs） Methods3. iTRAQ试剂标记胰酶消化产物（1）将iTRAQ试剂平衡至室温 （2）短暂离心使溶液集中在管底 （3）每管iTRAQ试剂中加入50 L异丙醇 （4）漩涡震荡混匀，短暂离心 （5）将每管iTRAQ试剂加入相应要标记的样品中 （6）震荡混匀，短暂离心 （7）如果混合后的溶液pH7.5，则加入5 L溶解缓冲液 （8）室温静置2 hrs （9）混合标记样品到一管中，漩涡震荡混匀，短暂离心 4. 通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品Methods 4. 通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品 (1) 混合标记样品过柱子，使标记的肽端吸附于柱子上 （2）配置不同浓度的盐溶液洗脱液 20 30 40 50 60 70 80 90 100 125 150 175 200 350mM （3）浓度不同的洗脱液分别冲柱，收集不同的洗脱液，标清洗脱液浓度 （4）利用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干，用流动相A（通常是10L， 98%水 2%乙腈 0.01%的TFA ）将肽端溶解 （5）上样点靶（含有基质和流动相），根据检测器的峰确定哪些点含有蛋白片段 （6）通常10L样品混合基质和流动相会点半个板，约600个点 （7）风干 Methods 4. 通过阳离子交换柱用的盐离子分离样品 Methods 5. 质谱检测肽端的标签和含量差异Methods 5. 质谱检测肽端的标签和含量差异Methods Advantage 双向凝胶电泳技术对疏水性蛋、分子量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量很低的蛋白难于分离或不能分离，而对于这些蛋白使用基于液相色谱及质谱技术的相对与绝对定量同位素标签技术（Isotope Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）能够得到有效的克服。
1. 在保留转录后修饰的状态下能够分辨更多的蛋白2. 能同时比较多组样品，目前最多可在相同分离条件下同时比较8组样品3. 可以对特定的目的蛋白做绝对定量或相对定量4. 对于实验的定量由于能同时分析多组样品而增加实验统计的相关性5. iTRAQ 试剂几乎可以与样本中的所有蛋白结合，容易受样本中的杂质蛋白及样本处理过程中缓冲液的污染，需要对样本进行预处理并尽量减少操作过程中的污染 此外，目前 iTRAQ 试剂仍非常昂贵，这也一定程度制约了它的广泛应用 iTRAQ 技术引入到抗菌肽的研究中他们使用 iTRAQ 结合多维液相色谱和串联质谱联用技术,研究经最小抑菌浓度下的人源中性白细胞抗菌肽 HNP-1 处理后大肠杆菌的细胞变化研究结果表明，一些参与糖酵解过程的蛋白酶含量丰度降低了.相反,许多蛋白如 AceE、AcnB 经 HNP-1 处理后含量丰度都显著提高了，而这些蛋白很有可能与抑制反应的补偿性应答有关 他们认为，这些蛋白含量丰度的增加或降低可能是由于抗菌肽的抗菌作用而引起所以，这些蛋白可以作为筛选更具抗菌活性的抗菌肽的靶蛋白Application example 利用iTRAQ 技术处理了猪肝细胞中的1476 种蛋白对其中880 种蛋白进行分析，在错误识别率小于 5% 条件下,他们发现一些与能量代谢、分解代谢、生物合成、电子传递、氧化还原酶类反应等有关的蛋白含量都大大增加了，这些蛋白在肝脏作为化学和能量工厂这一角色中都起着重要的作用 iTRAQ 技术鉴定了芸苔属植物保卫细胞中的相对蛋白成份 他们用相对定量的方法在经脱落酸处理过的样品中和对照组中鉴定出 431 种蛋白质在含量丰度相对上调的 66 种蛋白质中，与应激和防御有关的蛋白占大多数 38 种蛋白的含量丰度下调了，其中许多都与新陈代谢和蛋白合成有关 也未曾有人报道过这些蛋白与脱落酸敏感或与气孔的开合有关 他们的研究不仅建立了一个完整的脱落酸敏感蛋白库，而且鉴定出几种新的蛋白，为后续研究其在植物保卫细胞中的功能奠定了基础 Application example 将iTRAQ 技术引入了胃癌抗药性机制的研究中他们以抗长春新碱的 SGC7901 /VCR 细胞系和其亲本细胞系SGC7901为 研究对象,使用iTRAQ结合LC-MS/MS技术进行分析,共发现820种蛋白质,其中91种蛋白在SGC7901/VCR和SGC790中表达有差异 iTRAQ 技术研究了经鸟枪法处理后的无胰蛋白酶和部分含有胰蛋白酶的多肽，来比较正常的和实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠腰部脊髓的蛋白酶组成变化.他们发现了许多蛋白质如: 1-巨球蛋白(一种蛋白酶抑制剂) 1B-糖蛋白、2-微球蛋白、染色光多肽、硫化糖蛋白1等 分别用免疫耗竭和蛋白均衡器去除高分度蛋白技术将血浆蛋白进行预处理.随后用8杯的iTRAQ 技术进行标记，最后用强阳性离子交换树脂结合液相色谱和质谱联用技术分析 研究结果表明，两种预处理方法在识别蛋白数量上是互补的.好的色层析技术对于进一步分离经 iTRAQ 标记的多肽是非常重要的.两种预处理方法各自识别出 320和 248 种不同的蛋白，其中包括大量的生物功能蛋白和动态范围在 107内的蛋白Application example Prospect 国内结合多维液相色谱和串联质谱的 iTRAQ技 术 也 以 其 独 特的优点得到了比较广泛的 应用iTRAQ 技术虽然还有一些缺点和不足之处，但该技术在生命科学领域的中的应用价值已凸显，该技术必将在未来的蛋白质组学研究中得到更加广泛的应用，为进一步了解蛋白质在生命过程中的动态变化做出积极巨大的贡献。