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1、几种测定生物大分子分子量方法的比较摘要：生物大分子是指核酸(多核苷酸)、蛋白质 (多肽)、碳水化合物(葡聚糖或多糖)和脂类等。因为分子量小于500的单体可以通过聚合作用形成的大分子。测定生物大分子分子量方法是生物研究的核心之一，分子量是多肽、蛋白质、核酸、酶、多糖以及脂类等鉴定中的首要参数。当前医学，药学及生物科学学科之间交叉渗透为测定生物大分子分子量提供了更多的契机，本文对测定生物大分子分子量的方法：生物质谱法，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶渗透色谱法等技术的原理及优缺点进行综述。关键字：生物大分子 分子量测定 蛋白质 多肽 21世纪是生命科学的世纪，随着人类基因组，水稻基因组等的测序基本完
2、成，蛋白质和结构基因组研究也迅速发展。负责生命活动的是生物大分子，生物大分子之间的相互作用构成了生命活动的基础，因此，测定生物大分子的分子量，深入了解生物大分子的结构功能是掌握生命活动的关键。生物大分子是细胞的基本结构和功能单位,也是研究生命现象中的物质基础.生物体内的分子组成如何?哪些分子才算生物大分子?这些大分子有没有分子量的下限?怎么去测定生物大分子分子量？要想知道这些答案，需要多方位，运用多种方法进行研究。1. MALDITOF质谱技术对热敏感的化合物进行快速加热，可以避免其受热分解而转入气相，所以进行质谱法分析，采用MALDITOF法尤为适用，测定的化合物相对分子质量可达数十万。MA
3、LDIT0F的应用范围广泛， 包括有机小分子、有机高聚物和生物大分子。它在生物大分子领域的应用尤为引人注目。 基质辅助激光解吸附质谱技术是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据检测器的飞行时间不同，导致测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比。MALDI产生的离子常用飞行时间(timeof-flight，TOF)检测器
4、来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDITOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子分子量进行测量测。测定多肽与蛋白质分析生物工程产品中多肽与蛋白质是最主要的产品类型，对这些生物工程产品进行质量控制，已成为当前一个很重要的课题。MALDITOF已广泛用于多肽与蛋白质的准确测定及其纯度的评价。传统的测定，纯度及肽图的方法，应用凝胶电泳及高效液相色谱，这些方法不仅受多种实验条件(如色谱柱、流动相的选择等)所限，而且误差大，往往难以得到令人满意的结果，且操作十分复杂。应用MALDITOF对生物工程产品进行准确的，纯度及质量肽图进行测
5、定。对一级结构进行确证，得到了直观、准确(误差小于02)的结果。 这方面的报道不胜枚举，牛碳酸酐酶、蜂毒素、牛胰岛素、肌 红蛋白、胰蛋白酶原等都已经成功测定，测定过程简便快速。在生物界，生物分子的非共价特殊作用是分子识别的基础。因此，非共价复合物的检测在生物学上是一个重要的研究课题。近年来发展起来的ESI质谱已经成功地用于研究蛋白质一蛋白质和蛋白质一配体复合物的非共价结构特征 以及蛋白质的动力学研究。虽然MALDITOF的较高灵敏度 和肼。表征范围对于测定生物大分子物质普遍优于ESI质谱，但是它在检测非共价复合物的应用上却受到了供试品制备条件的限制。在这一过程中使用强的酸性基质或有机溶剂，一般
6、不利于非共价复合物的形成；而且，由于存在激光的诱导以及基质加合物的形成，常常干扰复合物的检测；同时 MALDITOF质谱的相对较低的分辨率使得它不适合于在小分子与大分子亚基单元之间形成复合物的研究。这些缺点的存在，使其在分析研究非共价复合物方面的报道较少。不过这一领域的尝试仍在继续。例如：MALDITOF成功检测了富勒醇与肌红蛋白和血红蛋白之间的强的相互作用，为富勒醇可能潜在的生物活性研究提供了可靠依据。与题目无关内容，要倒扣分的哦测定多糖近年来，人们对糖类化合物的生理功能有了新的认识，糖类化合物继蛋白质、核酸之后，成为生命科学领域中的又一研究热点。糖的性质与其大小密切相关，因此糖特别是多糖分
7、布的测定，在糖类化合物的研究和应用中有着重要的意义。传统的多糖测定方法，如渗透法、黏度 法、光散射法、凝胶色谱法等，不仅耗样多、误差大或受分子形状的影响，且各方法所测的性质不同，需要几种方法配合使用很不方便。而糖本身高极性、难挥发的性质以及多糖较高的和其的发散，使糖类物质的质谱表征比较困难。但MALDIToF注意大小写在这一领域显示出一定潜力和应用前景。在测定多糖时，往往得不到高质量区，主要是聚合度低的分子优先电离的趋势抑制高，多余的多糖离子化过 多余空格程。用凝胶柱处理过的多糖，分布范围变小，得到的 MALDI谱图效果变好。多糖的正、负离子基质辅助激光解吸 电离质谱(MAIDIMS)图谱已无
8、明显差别。这意味着寡糖、多 糖的离子化过程可能不同寡糖在激光解吸电离过程，离子 的缺标点形成主要是中性分子热蒸发并随后形成阳离子化的过程。 随着的增加，这种热力学解吸过程越来越困难。对高多糖来说，电离主要是依靠激光解吸电离的集合作用完成的，大量基质分子共振吸收激光能量后，通过集合作用使基质和供试品的固体溶液发生解聚，产生带有随机电荷量的分子簇和团粒，并在向真空蒸发过程中冷却，留下带电荷的大供试品离子。这种情况下，正、负离子生成几率差不多， 使得多糖的正、负离子MAlJDTTOF谱比较接近。综上所述， 糖类化合物辅助激光解吸电离的离子化过程与其大小 有关。低时，热力学过程占主导地位；高时，非热力
9、学过程占主导地位，这两种过程的差异，导致了寡糖和多糖正负离子MALDITOF谱图的差异。此结论显示出MALDI TOF对多糖的应用还需探索。测定核苷酸核苷酸也是具有极其重要生理功能的大分子物质，极性大，热不稳定，与蛋白质类似，MALDITOF在对核苷酸的测定方面，显示巨大潜力。用酶解法与MALDITOF分析结合，可测定较多碱基的核苷酸的碱基序列。MALDITOF对固相合成法合成的大分子核苷酸进行了测定准确表征了其合成的功效。 MALDlTOF与传统的磁式质谱相比，其特点有可实现纳秒量级的瞬时记录，经过多次瞬时记录累加得到的质谱图，其信噪比得到了极大的改善。具有高的离子流通率，因而获得高的灵敏度
10、，仅需约l pmol的供试品即可测定。 原则上没有范围限制 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性，提供样品分子的相对分子质量和丰富的结构信息，可用于大规模高通量分离分析和检测。它以其高灵敏度、低供试 品消耗量、能确立分子式等优点，在现代仪器分析中发挥着 越来越重要的作用。综上所述，MALDITOF作为一个新技术，它已经成为测定生物大分子的重要方法，尤其是蛋白组的研究中，可以鉴定细胞有哪些蛋白质组，是不可缺少的方法2电喷雾离子化质谱技
11、术。电喷雾电离质谱技术(electrospray ionization mass spec trometry，ESIMS)是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴， 随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或 多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 电喷雾电离质谱的优势在于它能方便地与多种分离技术联合使用，如液
12、一不标准质联用(LCMS)是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。优缺点：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费（2）对样品分子质量测试的灵敏度，分辨力和准确度都相当高（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳，高效液相色谱等，是解决非挥发性，热不稳定性，极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。3.FT Orbitrap（傅立叶变换静电场轨道阱）一个质谱分成3个来说，你这算偷工减料吗？在 1999 年的 ASMS 上，质谱学家 Alexander Makarov 报告用一种新的质量分析器静电场轨道阱进行高分辨和精确质量数测量。第一台Orbitrap质谱仪诞生于
13、2001年，在爱丁堡大学的实验室使用。Orbitrap 是近20多年来质量分析器的突破性技术。这是一种采用新结构 质量分析器和突破性技术的质谱仪器，离子在质量分析器里作轨道旋转和振荡，Orbitrap 质谱仪的检测方式是通过离子的旋转振荡产生的镜像电流，经微分放大后由 FT 变换器转换为各离子的振荡频率，最后计算出分子离子的质核比(m/z)。这种通过频率来测量质核比的方式，可以得到超高的分辨率，Orbitrap的质量分辨率介于FT ICR（傅立叶变换离子回旋共振质谱）和TOF（飞行时间质谱)之间,最高分辨率可达到10 万。继 2001 年第一台商品化的 Orbitrap 诞生后，ThermoF
14、isher在 2005 年 ASMS 上推出在结构、功能上创新扩展的第二代高性能 Orbitrap 质谱仪，即LTQ OrbitrapLTQ Orbitrap 质谱性能稳定可靠，使用维护方便，日常消耗低，满足普通实验室高标准的分析要求，使之真正成为一个实用性强的分析工具。LTQ Orbitrap 自从 2005 年6 月上市后，很快得到质谱工作者的接受，并在各重要研究领域被广泛使用， 主要应用范围涉及生命科学、药物研发、司法检验和食品安全等领域 ：（1）蛋白组学研究中蛋白质鉴定、翻译后修饰、寻找生物标记物 ;（2）药物发现 和开发各阶段，代谢产物鉴定，药物和蛋白质的相 互作用 ;（3）代谢组学
15、和各种差异比较定量和显著差异成份的结构鉴定等这一段无关内容可删除Orbitrap的工作原理：质量分析器形状如同仿棰体，由仿棰形中心内电极和左右 2 个外仿棰半电极组成。Orbitrap 对离子的操作步骤分为离子捕获、旋转运动、轴向振动和镜像电流检测。仪器工作时，在中心电极逐渐加上直流高压，在 Orbitrap 内产生特殊几何结构的静电场。当离子进入到 Orbitrap 室内后，受到中心电场的引力，即开始围绕中心电极作圆周轨 道运动，m/z 高的离子有较大的轨道半径。同时离子受到垂直方向的离心力和水平方向的推力，而沿 中心内电极作水平和垂直方向的震荡。外电极除限制离子的运行轨道范围，同时检测由离
16、子振荡产生的感应电势，其中水平震荡的频率和分子离子的质荷比 (m/z) 的关系可由以下数学公式=后半截是啥意思？来描述，可见轴向频率与离子的初始状态是无关的,这种不相关性造就 Orbitrap 具有高分辨率和高质量准确度的特性。从 Orbitrap 的每个外电极输出的时域信号经过微分放大器放大后由快速傅立叶转换变成频域谱，频域谱再进而转换为质谱，然后在 Xcalibur 质谱软件中处理输出.质谱方法是蛋白质组学研究的关键技术，质谱数据可提供蛋白质的分子量、氨基酸序列、翻译后修饰及位点、差异蛋白比较等信。LTQ Orbitrap Velos 可对蛋白质酶切后的众多肽段的精确分子量和二级质谱同时测定，再经过数据库检索，得到蛋白质组的高通量鉴定。Orbitrap 质量分析器使得代谢组学的整体研究手段得以进一步简化。例如，LTQ Orbitrap 的分辨率使得色谱分离过程大
