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1、版纳微型猪近交系FANK1基因CDS克隆、 qPCR表达及功能生物信息学分析霍晋华张霞王配华中农业大学生命科学技术学院云南农业大学动物科学技术学院摘要：【目的】获得猪FANK1基因CDS序列、组织表达和蛋白质功能信息。【方法】以 GenBank下载的猪及近缘物种的FANK1 mRNA序列为参考序列，设计特异引物从 版纳微型猪近交系（BMI）睾丸组织中扩增FANK1基因完全编码序列及部分侧翼 序列。应用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个重要组织的FANK1 mRNA转录表 达水平，并对FANK1翻译的蛋口质序列进行多种功能生物信息学分析，预测 FANK1蛋白质的功能，最后构建FANK1多物
2、种氨基酸系统进化树。【结果】获得 T BMI FANK1编码区序列长1 041 bp,编码346个氨基酸，序列己提交GenBank, 基因登录号为KU705617和KU705618,对应的氨基酸登录号为A0C89035和 A0C89036o基因组结构分析表明FANK1基因定位于猪14号染色体，有11个外显 子和10个内含子。多组织相对荧光定量表达分析表明FANK1基因在睾丸、尿道 球腺和精囊腺中呈高表达水平;在其他组织中呈中低表达水平。功能生物信息学 分析表明FANK1蛋白质含有2种保守结构域FN3和ANK,无跨膜螺旋结构，无N 端信号肽序列，二级结构以无规卷曲为主，N末端和C末端均亲水，有4
3、类功能 活性位点。系统进化分析表明，FANK1基因在进化中高度保守，且与牛、羊的亲 缘关系最近，符合物种的系统分类学。【结论】成功克隆了版纳微型猪近交系 FANK1基因的CDS序列并进行了多种组织表达分析，为后续研究FANK1基因在小 型猪精细胞分裂及调节信号通路方面的作用及功能奠定基础。关键词：纤连蛋口 3 （FN3）;锚蛋口重复（ANK）;版纳微型猪近交系;组织表达;生物 信息学；作者简介：霍晋华，本科，主要从事生物技术研究，E-mail:jinhuahuo2016163. com,作者简介：王配，博士，实验师，主要从事动物分子遗传学研究， E-mail:peipei99999126. c
4、om。收稿日期：2017-02-24基金：国家自然科学基金项目(31660637; 31460580; 31660650)CDS Cloning, qPCR Expression and Functional Bioinformatics Analysis of FANK1 Gene from Banna Mini-pig Inbred LineHUO Jin-hua ZHANG Xia WANG PeiFaculty of Life Science and Technology, HuazhongAgricultural University; Faculty of Animal Scien
5、ce and Technology, Yunnan Agricultural University;Abstract：Objective In order to obtain the CDS sequence, tissue expression profile and protein function information of swine FANK1 gene. Methods The FAXK1 mRNA sequences of pig and related species from GenBank were used as referenee sequences, we desi
6、gned specific primers and amplified the coding sequences and flanking sequence of FANK1 gene from Banna mini-pig inbred line (BM1) testis tissues. Real-time qualitative PCR was applied to analyse the FANK1 gene expression profiles of15 important tissues. FAXK1 protein sequence was used to carry out
7、functional bioinformatics analysis and construct multiple species phylogenetic tree. 【ResuIts】A coding sequence of 1 041 bp of BMI FANK1 gene was obtained with GcnBank accession number KU705617 and KU705618, which encoded a protein of 346 amino acids, with GenBank accession number A0C89035 and AOC89
8、036. Genomic structural analysis revealed that the FANK1 gene was located on porcine chromosome 14 and consisted of 11 exons and 10 introns. Real-time quantitativc PCR in multi-tissues indicatcd that FANK1 gene expressed highly in the testis, urethral gland and seminal vesicle, middle or low express
9、ion in the other tissues. Further functional bioinformatics an alysis indicated that FANK1 protei n contained two con served domains FN3 and ANK without tra nsmembrei ne region and sig rml pep tide seque nces. Its seco ndary st rue turc was predom inemtly ran dom coils and its Nt erminal andC-termin
10、al were hydrophilic. FANK1 protein had four kinds functional active sites. Phylogenetic analysis demonstrated that BMI had the closest relationship with cattle emd sheep, which was coincident with classical taxonomy.【Conclusion】 We have successfully cloned the FANK1 gene of Banna mini-pig inbred lin
11、e, and detected this gene expression in 15 pigs tissues. The results of this article would lay a foundation for further study of the gene functions in the process of spermatocyte division and regulation of signal pathway.Keyword：fibroncctin type III (FN3) ; ankyrin repeats (ANK) ; bemna mini-pig inb
12、red line (BMI) ; tissue expression; bioinformatics;Received： 2017-02-24据报道非细胞凋亡蛋白FANK1基因在睾丸中特异性表达1-3,通过多物种比对, 同源性较高，是高度保守的基因如。FANK1由FM3和小K两种保守结构域组成 臣1。有研究证明，FANK1是一种非细胞凋亡蛋白，它是通过激活AP-1 (activator protein 1)信号通路来抑制细胞凋亡的也卫1，而且FN3和AMK都 有增强AP-1通路活性的作用Q。Wang H.等通过酵母双杂交的方法，发现FANK1 与Jabl (Jim活化结构域结合蛋白1)可以相互
13、作用DL研究发现，Jabl是AP-1 信号通路的共同激活蛋白宜。通过构建敲除FANK1基因的小鼠模型，发现敲除 FANK1基因的小鼠细胞凋亡数目高于正常小鼠回。通过RT-PCR和Western Blot 证明，FANK1基因在精细胞减数分裂过程中以及不同日龄的小鼠睾丸中的表达量 不同9。版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)是全球第一个培育成 功的人型哺乳动物近交系，因其基因高度纯合、遗传背景清楚，生理学、疾病发 生机理和解剖学等方面与人类极为相似，从而可为新药临床前安全性评价、猪基 因组计划中的功能基因研究、人类疾病动物模型制作和人类异种器官移植等
14、众多 领域提供实验材料和器官供体，具有重要的研究应用价值10-13 但是在正常 繁育BMI的37年来，有多个亚系断代，前期研究发现是部分公猪不育造成的， 这些不育公猪已成为阻碍其群体进一步扩人的障碍，故版纳微型猪近交系雄性 不育方面的基础研究是亟待开展的重要研究方向。鉴于FANK1基因在雄性哺乳动 物精子生成和睾丸功能中的重要作用，本研究通过克隆版纳微型猪近交系 FANK1基因，确定其序列特征;通过in RNA的多组织表达谱确定其发挥功能的重 要组织;通过对蛋白质进行功能牛物信息学分析预测其功能，为今后进一步深入 研究FANK1基因在BMI公猪繁殖力方面的功能奠定基础。1材料和方法1.1材料
15、屠宰BMI成年公猪，取睾丸和附睾(性腺)，前列腺、精囊腺和尿道球腺(副性 腺)，5种雄性牛殖重要相关组织;取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃脏、 脑、肌肉、十二指肠(小肠)、结肠(大肠)等常规组织;共15种组织样品。1.2方法 1. 2. 1总RNA提取和第一链c DNA合成参照说明书利用柱式RNA提取试剂盒(Ta Ka Ra:9767)分别提取各组织总RNA, 用核酸蛋白测定仪检测所提RNA的浓度及纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA 的完整性，合格样品按反转录试剂盒(TaKdRa:6210A)操作说明书反转录为第 一链c DNA保存备用。1.2.2引物设计及合成根据 Gen Bank 下载
16、的牛(NM_001003904)、猫(XM_006938270)、羊 (XM_012108577)、人(NM_145235)、马(XM_001490071)等物种的 FANK1 m RNA 序处 结合猪表达序列标签EST序列(CV865262和CX063842)，再参照Gen Bank 下载的预测的猪 FANKlm RNA 序列(XM_001924803 XM_005671566、 XM_005671567、XM_005671568),利用 Oligo 7 软件设计 F/&特异引物 (比:CGGCCTGGGAGCAGCTGAC, Rl: AATGTCTGGCCTCAGGAATGC)来扩增 FANK1 基因全长 CDS序列及部分5和3侧翼序列，设计F2/R2特异引物(F2：AACGACCCGAGAGCCCAT, R2: AACGACCCGAGAGCCCAT)扩增 97 bp,并以 GAPDH 基因为内参(F: CCTTCATTG
