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1、第五章 基因的分离与克隆第二节、功能克隆法：从蛋白质到基因做好基因工程实验n理解目的意义n熟知基础理论n熟悉各种酶和载体n掌握基本技术n规范操作动作征集 购买基因工程中的基因来源 分离与克隆序列已知基因的克隆序列未知基因的克隆已知序列基因的克隆化学合成基因 物理化学法直接分离基因利用PCR扩增法分离基因构建文库分离法分离基因序列未知基因的克隆 如何获得目的基因？功能基因组学研究的重要内容第二节、功能克隆法： 从蛋白质到基因蛋白质多样性和可变性的特点蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中是各不相同的同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是不断改变的在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其
2、变化与正常生理过程的不同n功能法克隆基因，就是从生物体的组织或器宫中分离特异蛋白质，然后根据蛋白质的氨基酸序列反推出相应的核苷酸序列，并以此为依据合成DNA探针，从基因文库中筛选出目的基因n在基因工程发展的早期阶段，许多基因都是通过功能法克隆的一. 蛋白质的分离纯化二. 蛋白质的鉴定与序列分析三. 基因序列的确定四. 分离基因功能克隆法分离基因的主要步骤一、 蛋白质的分离纯化(一) 材料获得 含目标基因天然材料，突变体 差异处理，诱导基因表达 (二) 粗分离1 破碎细胞动物，植物细胞：匀浆，研磨大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶2 抽提 1. pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸盐，醋酸盐，
3、柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白在此pH条件下稳定 2.温度：低温如410，蛋白酶活性较低 3.离子强度：如0.10.2 M NaCl或KCl 4.其他成分：还原剂如NaHSO4，维生素C；巯基保护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂EDTA，EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF3 初步分离 1.分离细胞器：离心，超离心 2.除核酸：酶法DNase,RNase；超声波 3.除脂肪：丙酮，脂肪酶4 粗分蛋白 1.盐析： (NH4)2SO4沉淀 2.有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮 3.等电点沉淀：除去杂蛋白 4.热变性：除去杂蛋白5 除盐 1.超滤 2.凝胶过滤 3.冻干(三) 细分离1 凝胶过滤：又叫分子筛
4、层析，将蛋白质按照分子量的大小分开 介质： Sephadex: (交联葡聚糖) G25, G50, G75, G100 Bio-gel: (聚丙烯酰胺) P-6，P-30，P-60，P-100 Sepharose: (琼脂糖) 2B, 4B, 6B Sephacryl: S100, S200, S300 Superose: HPLC superdex: HPLC 装柱：均匀，无气泡。 上样：上样量层析一般步骤：介质装柱平衡上样洗涤洗脱收集 举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶n溶菌酶：分子量为14KD， 等电点为11，耐热，n能够水解革兰氏阳性细菌的细胞壁，鸡蛋清中含量丰富。纯化步骤：150克鸡蛋壳，
5、1 NaCl0.05 N HCl,40抽提20醋酸调pH4.6，75处理3分钟，离心取上清加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量50的CaCl2，离心取上清在上清中加NaCl至终浓度5，将样品加到Sephadex G-50层析柱中(5X25cm)，0.6% NaCl洗脱，流速40毫升/小时，收集洗脱液5ml/管测活，合并含溶菌酶部分聚乙二醇浓缩结晶2 离子交换层析原理：离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。 离子交换介质： (1)离子交换树脂 (2)离子交换纤维素
6、 (3)Sepharose Fast Flow: (4)Sepharose High Performance：分辨率较F.F.高 (5)HPLCSepharose Fast Flow:I 分类： 阴离子交换 强度 功能基团 + DEAE 中等 OCH2CH2NH(CH2CH3)2 + QAE 强 OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 阳离子交换 强度 功能基团 CM 弱 OCH2COO- SP 强 CH2CH2CH2SO3-II 选择： i 根据蛋白质的等电点选择介质 ii 根据分离目的选择介质注意问题： I 缓冲液的选择： 阳离子：Tris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐 II 介质处
7、理： 阳离子： Na+ 型 阴离子： Cl- 型 III 洗脱： 原理：i改变盐浓度 ii改变pH值 方式：i连续洗脱 ii梯度洗脱3 疏水相互作用原理：利用蛋白质疏水性的差异进行分离。介质： HPLC： Phenyl：分离蛋白质 C18：分离肽段 常压介质： 疏水性由弱到强：丙烷基 戊烷基 苯基 辛烷基影响因素：高盐结合，低盐洗脱 举例：利用Phenyl-Sepharose F.F.纯化牛脑钙调素取新鲜或冷冻牛脑100mg，加入100毫升预冷的抽提液（50mM Tris-Cl, 20 mM NaHSO4, 0.15 M NaCl, 1mM EDTA,1mM DTT, 1mM PMSF, pH
8、 7.5）,匀浆分批热处理每次20毫升，迅速升温到90并维持3分钟，降温到10以下离心15,000rpm， 30 分钟，取上清，补加CaCl2到5mM上清加到用抽提液平衡的Phenyl-Sepharose F.F.柱上,并用平衡液洗涤用含有0.5M NaCl的平衡液洗涤用50mM Tris-Cl, 20 mM NaHSO4, 0.15 M NaCl, 2mM EDTA,1mM DTT, pH 7.5洗脱液洗脱收集洗脱峰4 亲和层析原理：亲和层析是一种吸附层析，利用蛋白质特异性进行分离。如，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体
9、）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 介质： 载体选择：Sepharose 4B, Sepharose CL 4B, Sepharose Fast Flow, Sepharose High Performance 配基选择：抗原抗体，酶抑制剂，酶底物，激素受体，凝集素糖蛋白，金属结合蛋白螯和剂，His融合蛋白Ni-NTA柱(四)电泳n 电泳是指带电粒子在直流电场中移动的现象。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺n经过聚
10、合交联从而形成的三维空间凝胶网络。1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳n 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系nSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异分为连续系统和不连续系统，由于SDS不连续系统具有较强的浓缩效应，因此具有更高的的分辨力也就更多地为人们所采用UGPase-His fusion proteins were IPTG-induced (
11、A) and purified by affinity chromatography using Ni-NTA His Bind Resin (Novagen) 2 等电聚焦电泳n蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化 。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。n等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分
12、子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。3 双向电泳n1975年，OFarrell 首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白n双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白质图谱操作（1）等电聚焦（2）平衡胶条（3）第二相SDS-PAGE二、 蛋白质的鉴定与序列分析（1）Edman降解法测序（2）C 端测序（
13、3）蛋白质的质谱分析（4）蛋白质组信息学1 Edman降解法测序n1950年P. Edman公布了一项新的氨基酸序列的测定技术，即运用苯异硫氰酸酯与氨基酸的反应（Edman反应）。这种技术每次都只是从蛋白质的N端解离和鉴定一个氨基酸残基nEdman降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程首先使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽然后PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物接下来将该衍生物用有机溶剂（例如氯
14、丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸n通过柱层析可以将水解液中的每一种氨基酸分离出来并进行定量PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物全自动蛋白/多肽序列仪 2 蛋白质C端测序C 端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；N端封闭蛋白质C端序列测定方法目前有化学法、酶法、C端片段分离法以及物理法等 （1）最成功的方法是1926年Schlack和Kum
15、pf提出(异)硫氰酸法用于蛋白质C端序列测定（2）直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基的C端顺序测定（蛋白外切酶） （蛋白外切酶） （蛋白外切酶） （蛋白外切酶）3. 质谱法用于蛋白质测序（1）必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。（2）20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千（3）20世纪80年代末出现了电喷雾质
16、谱和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。2D 电泳 Mass 测序分析质谱分析的特点 n很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息n能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定n同时具有准确性、易操作性、快速性, 每次质谱分析只需数分钟蛋白质的质谱分析原理n蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(/值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的/值，分析鉴定未知蛋白质蛋白质的质谱分析方式 n蛋白图谱(protein mapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列n利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基.n用化学探针或酶解使蛋白或肽从端或端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(ladder sequencing)，经质谱检测，由相邻峰
