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1、强力霉素对兔制动骨关节炎模型治疗作用【摘要】目的探讨强力霉素对兔制动骨关节炎模 型的治疗作用及其作用机制。方法新西兰大白兔24只， 随机分为正常、模型、对照和治疗组，每组6只。除正常组 外，所有动物以石膏固定左下肢于伸直位4周。然后治疗组 给予强力霉素口服治疗，4周后观察股骨内課的退变情况， 并检测软骨II型胶原含量、尿激酶型纤溶酶原激活剂 （urokinase type plasminogen activator, uPA ） 禾口基质 金属蛋白酶（matrix metallo proteinase,MMP） -13 水平。结果治疗组软骨退变较模型和对照组明显减轻，模型与 对照组之间II型胶
2、原含量、uPA和MMP-13的表达无统计学意 义（P>；0. 05）,其它各组均有显著统计学差异（P<；O. ODouPA 与 MMP-13 的表达呈正相关（r二0. 973,P<；0. 05）。结论强力霉素可抑制软骨退变，改善软骨结构。其作用 与uPA、MMP-13的表达抑制有关。【关键词】骨关节炎；强力霉素；尿激酶型纤溶酶原 激活剂；基质金属蛋白酶Abstract： Objective To investigate the effects of doxycycline on rabbit immobilized osteoarthritis and their mechanis
3、m. Method Twenty four rabbits wererandomly divided into normal,model,control and treatment groups,with 6 rabbits in each group .All of the animals were immobilized the lower left limbs withplaster bandage for 4 weeksexceptnormal group .Doxycycline was orally given to treatmentcondyle oflevels ofgrou
4、p .Cartilage degeneration of the medial femur was observed at 4 weeks and the collagen II,uPA and MMP 13 were tested. ResultCartilage degeneration in treatment group was significantly slighter than those in model and control groups .Data of collagen II,uPA and MMP 13 between model and control groups
5、 had no significant difference,but a noticeable statistical difference among other groups .The uPA activity was positively correlated with MMP 13. Conclusion Doxycycline inhibits the degeneration process of cartilage and improves the strueture.The effects may be related to the inhibition of uPA and
6、MMP 13.Key words : osteoarthritis； doxycycline； urokinase type plasminogen activator； matrix metalloproteinase骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种渐进性的退行性 关节病，其发病与增龄、遗传、外伤等因素有关。关节生理 环境失衡导致的炎症性级联反应在0A的发病中起着重要的 作用11而针对病理生理学改变的0A病情改善药物成为 目前研究热点。本实验用强力霉素治疗兔制动0A模型来探 索其治疗价值。1材料和方法1. 1动物及试剂新西兰大白兔（新疆医科大学实验动物中心，医动 字第16
7、-003号）；强力霉素片（常州制药厂，批号：07121015）； II型胶原单克隆抗体（Merck ） ； MMP-13单克隆抗体 （CHEMICON）； uPA抗体（武汉博士德）。1. 2模型的建立与分组健康成年新西兰大白兔24只，雌雄各半，平均体重 约2. 5 kg,随机分为正常、模型、对照和治疗组，每组6 只，正常组不予特殊处理，其他各组动物以石膏固定左下肢 制作0A模型，固定范围自腹股沟下2. 0 cm处至足趾，膝 关节伸直位，踝关节背伸60 o 4周后去除石膏，处死模型 组动物，观察左膝关节退变情况，然后治疗组给予强力霉素 25 mg/d,分2次灌胃治疗，对照组给予等量生理盐水。于
8、用药4周后同时处死，观察比较。1. 3组织取材先行左膝关节大体观察，然后以锐利刀片小心切取 股骨内侧課负重区同部位钙化层上软骨约3 mmX5 mm, 10% 中性甲醛溶液中固定后，做成石蜡切片，留做免疫组化染色, 测定II型胶原含量和uPA、MMP-13的表达情况；再将剩余全 层软骨一并切除，进行HE染色和甲苯胺蓝染色。1. 4检测指标关节软骨甲苯胺蓝染色，Mankin评分；免疫组化染 色结果以Olympus dp70数码成像分析系统，在高倍镜下随 机选取10个视野，分区测定II型胶原I0D值与uPA和MMP-13 阳性细胞占总细胞数的比率。1. 5数据处理所得数据以土s表示，应用SPSS 1
9、3. 0软件处理， 进行方差分析和t检验。2结果2. 1大体与光镜观察正常关节软骨面光滑，瓷白色，无溃疡及缺损。光镜下 层次清晰，无裂隙，潮线完整，细胞排列有序。模型组关节 内有黄褐色积液，关节囊增厚，滑膜增生，软骨面有糜烂溃 疡，甚至缺损，周围软骨增厚变软，呈灰黄色，关节边缘可 见骨赘形成。光镜下染色不均，部分区域全层软骨缺损，缺 损区周围细胞和基质增生明显，细胞数增多，紊乱，甲苯胺 蓝染色淡染。对照组增生反应仍较明显。细胞增生，簇集， 结构紊乱，细胞簇集处甲苯胺蓝染色加深，远离部位染色仍 较淡。治疗组退变较轻，缺损区周围软骨面较光滑，色泽稍 暗，无明显骨赘。镜下软骨增生不明显，结构较规则，
10、甲苯 胺蓝染色轻度减退，细胞数基本正常(图1)。2. 2 II型胶原免疫组化测定正常软骨II型胶原染色均匀分布于钙化层以上的各层软 骨，模型组和对照组主要集中在软骨深层，不均匀，呈斑片 状深染区域，表中层表达明显减少，IOD值显著低于治疗组 (P<；O. 01),治疗组染色较正常组淡，主要分布于移行 层中下部和深层上部。2. 3 MMP-13和uPA免疫组化测定正常软骨MMP-13和uPA仅有微弱表达，模型组和对照组 表达明显增强，对照组MMP-13较模型组为弱(P<；0. 05), 模型组与对照组uPA表达无统计学差异(P>；0. 05),治 疗组两者表达均明显减弱(P<；0
11、. 01)(表1、图2)o MMP-13 与uPA的表达呈正相关(“0. 973,P<；0. 05)o表1各组 指标Mankin评分，II型胶原免疫组化、MMP-13免疫组化测 定结果3讨论强力霉素是四环素类药物。除抗生素作用外，它还可通 过多种途径对0A软骨起保护作用2o MMP是软骨降解的主 要蛋白酶之一，能直接降解软骨的II型胶原和蛋白聚糖，破坏软骨结构。MMP-13在关节软骨降解中起主要作用3o强 力霉素则可以通过其螯合Zn2+和Ca2+的特性抑制MMP的活 性，使病情得到改善。本实验正常组MMP-13仅有微弱表达, 模型组和对照组呈高表达。强力霉素治疗后，退变软骨的损 伤性反应明
12、显减轻,MMP-13活性明显低于模型组和对照组（P 0.01）ouPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，主要通过与uPAR结合发 挥作用，但uPA也可将纤溶酶原激活为纤溶酶，间接激活其 他蛋白水解酶以及直接降解细胞外基质和基底膜等4MMP 的激活因子可由软骨细胞产生的uPA利用纤溶酶原生成的纤 溶酶激活，从而使0A关节软骨中MMP的表达增高，II型胶 原被裂解而变性。研究表明，uPA介导的细胞外基质蛋白裂 解作用与0A的关节软骨和骨的破坏密切相关5o本实验 中，正常组uPA仅有微量表达，模型组和对照组的表达明显 增高，治疗组表达明显减弱，与MMP-13表达呈正相关。表 明强力霉素并不仅是MMP-13的抑
13、制剂，同时对uPA的表达 也有抑制作用，可能是一种潜在的uPA抑制剂。关节软骨损害是0A的基本病理变化，而软骨细胞外 基质的合成与降解失衡是造成软骨退变的重要原因之一。正 常情况下，软骨细胞合成II型胶原和蛋白聚糖等细胞外基 质，同时还合成少量的uPA、MMP以及它们的天然组织抑制 剂，以维持软骨的正常新陈代谢。0A时，关节软骨细胞克隆, 基质合成加速，但新合成的软骨细胞外基质最终不足以维持 正常的软骨结构，从而发生了软骨的进行性破坏。本实验模 型组关节软骨有明显的增生性反应，但是增生组织结构紊 乱，已失去正常的关节软骨功能。治疗组关节软骨结构明显 改善，Mankin评分和II型胶原的含量明显
14、增高(P0. 01), 对照组则变化不明显。考虑为强力霉素抑制了 uPA和MMP-13 的表达，使软骨的结构和功能趋向正常化。但是对于已经造 成的软骨损伤则无法恢复，只能由纤维软骨增生替代。目前0A的治疗仍以缓解症状为主。而病情改善药物 与症状改善药物的合理搭配，可能是一种更为合理的治疗方 案6。本实验表明，强力霉素能有效抑制uPA和MMP-13 的表达，改善软骨的结构和功能，可能是一种有效的病情改 善药。本实验为进一步的临床研究提供了相关理论依据。【参考文献】 1 Krasnokutsky S,Samuels J,Abramson SB. Osteoarthritis in 2007 J .
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