大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化课件

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1、大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化创新实验I-化学生物学课程组 王骊丽实验四NORTHWEST UNIVERSITY化学国家级实验教学示范中心大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化 基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。 重组蛋白分离纯化：细胞收集 、破碎；包涵体的溶解； 蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法； 蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法实验技能训练要点主要新知识大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化 仪器分析：色谱技术 液相色谱技术 仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振 化学生物

2、学导论：蛋白质、酶 蛋白质与酶化学：重组DNA技术 蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征. 有机化学：荧光探针实验技能训练要点主要知识回顾大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化背景知识 实验实验 室研发发从E.coli 中得到一个具有活性的治疗疗用药药物蛋白或者研究用蛋白纯纯品，包括以下步骤骤： 目的基因DNA片段的获获得；E.coli 重组组表达载载体的构建；在E.coli 中对对目的基因进进行表达；目的蛋白从E.coli 裂解液中的纯纯化；规规模化生产产工艺艺（包括工程菌发发酵、复性与纯纯化工艺艺的放大等）的建立。关键词键词 ：重组组人粒细细胞-集落刺激因子、液相色

3、谱谱复性与纯纯化Recombinant human granulocyte colony stimulating factor, Renaturation and purification by liquid chromatography大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化实例：粒细胞白血病粒细胞白血病(ML) 在我国其发病率占成人新诊断白血病20%以上，年发病率为10万分之1。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用HSCCLPCMPGMPMEPPro-TPro-BTBNK单核细胞粒细胞巨核细胞红细胞SCF;IL-2S

4、CFEPOSCFSCFSCFSCFIFN-SCF基质细胞SCF大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化名称氨基酸残基数二硫键键数相对对分子质质量与等电电点主要产产生细细胞主要生物学rhG-SCF177分子中含有5个半胱氨酸残基，可形成两个二硫键键19.6kD;pI6.0巨噬细细胞、内皮细细胞及纤维纤维 母细细胞能高度特异性的刺激中性白细细胞系的前体细细胞存活、增殖和分化，同时时也是成熟的中性白细细胞的功能活化因子rhG-CSF的理化性能与生物学功能大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化复性与纯纯化方法添加剂剂质质量回收率(%)纯纯度(%)生物活性(108IU/mg

5、)IEC3.0 mol/L urea,2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L GSSG49.0963.0HICN.R.42.696.82.1SEC15% glycerol (v/v),2.5m mol/L GSH, 0.8 mM GSSG30.0831.2脲脲梯度SEC15% glycerol (v/v), 2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L GSSG46.1N.R1.0AFC2.0 mol/L urea32.0971.8AFC3.0 mol/L urea39.0972.3几种PFLC法复性与纯纯化rhG-CSF包涵体结结果比较较大肠杆菌表达重组人粒细胞集落

6、刺激因子包涵体的复性与纯化实验内容提要一、实验实验目的二、实验实验原理三、实验仪实验仪器与试剂试剂六、实验实验延伸五、实验结实验结果与讨论讨论四、实验实验步骤骤与方法 思考题题 参考文献大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化西北大学化学与材料科学学院一、实验目的 掌握包涵体的变性、复性的基本原理； 熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法； 熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。 通过人粒细胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因扩增和在大肠杆菌DH5中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特点;了解二硫键形成与构象的关系；大肠杆菌表达重组人粒细胞集落

7、刺激因子包涵体的复性与纯化基因工程技术术是指人们们按照自己的愿望，通过过体外DNA重组组和转转移等技术术，有目的地改造生物物种，使现现有物种出现现人类类需要的性状的技术术;以大肠肠杆菌克隆表达系统为统为 基础础的原核基因工程技术术，使得人们们可以在大肠肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论论和应应用价值值的蛋白。二、实验原理-基因工程技术大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化 大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在； 包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性； 包涵体能够溶解于强的变

8、性剂，如8mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。二、实验原理包涵体的形成和特点 超声破碎包含体外周质胞浆沉淀 可溶部分洗涤溶解离心离心包涵体复性大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化 直接稀释法（Directdilution），包括透析法和超滤法 液相色谱复性法（Chromatographicmethodsforproteinrefolding） 人工配基辅助的蛋白复性（Artificialmolecularchaperoneassistedproteinrefolding)二、实验原理体外复性的主要途径大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化液相色谱复性蛋

9、白的过程蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化三、实验试剂和仪器 尿素（成都金山化学试剂试剂 厂），乙腈腈（色谱纯谱纯 ，天津科密欧化学试剂试剂 有限公司）；三氟醋酸（分析纯纯，Fluka公司）；硫酸铵铵、氢氢氧化钠钠、磷酸二氢钾氢钾 、氯氯化钠钠、浓盐浓盐 酸等均为为分析纯纯（西安化学试剂试剂 厂）。-氰氰基-4-羟羟基肉桂酸（CHCA）均购购自Sigma公司（St.Louse，MO，美国）。试剂大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化西北大

10、学化学与材料科学学院三、实验试剂和仪器纯水仪离心机二氧化碳培养箱快速蛋白纯化仪日立F-4500荧光光谱仪仪器大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化天数实验内容实验准备相关知识点第1天包涵体粗分离、溶解配制变性剂及其缓冲液，装填色谱柱细胞的破碎，离心技术第2天利用稀释法、HIC法进行包涵体的复性与同时纯化配制色谱流动相稀释法、色谱复性与纯化原理第3天理化性质分析，分子量，蛋白质含量SDS-PAGE、质谱紫外分光光度计电泳、质谱技术第4天一级结构、高级构象、生物学活性荧光光谱仪、配制测定活性缓冲液荧光光谱、MTT法第5天数据处理、整理实验报告环节1环节2环节3四、实验步骤与方法实验

11、天数大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化四、实验步骤与方法PCR扩增技术获得rhGC-CSF基因插入克隆载体进行测序回收扩增片断插入表达载体表达5L或50L发酵罐蛋白的生物活性和理化性质分析正确的基因筛选表达最好的菌株获得包涵体蛋白多种方法复性重组包涵体蛋白获得有活性的蛋白大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化四、实验实验 步骤骤与方法-流动动相组组成 普通SEC：0.15mol/LNaCl，3.0mol/Lurea，0.05mol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA+1.0mmol/L，pH8.0GSH/0.1mmol/LGSSG，15%甘油; 脲脲

12、梯度SEC：A为为0.05mol/LTris(pH8.0)，1.0mmol/LEDTA，0.15mol/LNaCl，2.5mmol/LGSH+0.8mmol/L；B为为8.0mol/Lurea。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化1、普通SEC法对hG-CSF复性与纯化 流动动相平衡Superdex75(16/20)柱子，然后将200L8.0mol/L脲脲溶解变变性的rhG-CSF溶液直接进样进样 到平衡好的色谱谱柱中，用平衡时时所用的流动动相洗脱复性的rhG-CSF。 流速1.04.0mL/min，检测检测 波长为长为 280nm。 收集复性的rhG-CSF馏馏分，测测定蛋

13、白浓浓度。 将收集液用稀盐盐酸将其pH调调至4.0，然后对储对储 存液10.0mmol/LNaAc缓缓冲液(pH4.0)透析，透析后的含rhG-CSF的溶液用于测测定生物活性。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化2、脲梯度SEC复性rhG-CSF 用流动动相A和B按一定比例的混合液平衡色谱谱柱，然后在10或者15mL内将B液浓浓度增至100%。按上述方法平衡后，将不同体积还积还 原变变性的rhG-CSF直接进进入SEC色谱谱柱，然后以2.0mL/min的流速用B液洗脱。检测检测 波长长280nm。 收集复性的rhG-CSF，用稀盐盐酸将其pH调调至4.0，然后对储对储存液10

14、.0mmol/L醋酸钠缓钠缓 冲液（pH4.0）透析。透析后的含rhG-CSF的溶液用来测测定蛋白浓浓度和生物活性。大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化优优化的条件下复性与纯纯化 普通SEC法：流动动相为为0.15mol/LNaCl,0.05mol/LTris,1.0mmol/LEDTA,2.5mmol/LGSH,0.8mmol/LGSSG,3.0mol/Lurea,15%甘油(v/v)，pH8.0； 脲脲梯度SEC法：流动动相为为0.15mol/LNaCl,0.05mol/LTris,1.0mmol/LEDTA,2.5mmol/LGSH,0.8mmol/LGSSG,15%甘

15、油(体积积比)，pH8.0；流动动相B：流动动相A+8.0mol/L脲脲 流速为为2.0mL/min,检测检测 波长长280nm大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化 rhG-CSF的SEC复性与同时纯时纯 化产产物色谱图谱图 ； 复性与纯纯化产产物SDS-PAGE分析图图； 紫外分光光度法测测定复性与纯纯化产产物含量结结果； 荧荧光光谱谱表征复性前后的构象；五、实验结果与讨论大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化SEC复性rhG-CSF的色谱图实线实线 代表rhG-CSF的洗脱曲线线，*表示复性的rhG-CSF脲梯度SEC复性rhG-CSF的色谱图五、实验结果

16、与讨论-色谱图大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化 1 2 31,rhG-CSF包涵体提取液;2,分子量标标准蛋白(从底部到顶顶部依次为为14,400;20,100;31,000;43,000;66,200;97,400Dalton);3,SEC复性并部分纯纯化后的rhG-CSF五、实验结果与讨论-电泳分析大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化进样量 (L)脲梯度SEC的比活 (107 IU/mg)脲梯度SEC的质量回收率 (%)普通SEC的比活(107 IU/mg)普通SEC的质量回收率 (%)10012.853.212.331.420012.152.811.930.150010.446.18.124.77008.941.77.019.110008.131.85.89.3脲脲梯度SEC和普通SEC对对rhG-CSF复性的比较较五、实验结果与讨论-对比分析大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化五、实验结果与讨论-蛋白的构象表征 圆二色谱法荧光光谱法大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化 使用超声波时应控制强度在一定的限度