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1、检测结直肠癌组织中miR-21, miR-106a, miR-143的表达水彭志平 刘紫玲 史学森(通讯作者)【摘 要】 目的 探讨良性结肠腺瘤与结肠腺癌组织中Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-143-3p, Hsa-miR-106a-5p表达水平的差异对临床诊断结肠腺瘤及癌变可 能的意义。方法利用荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测结肠腺瘤、结肠癌患 者组织及瘤旁组织中 Hsa-miR-143-3p, Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p 的表达水 平，并分析三者的表达对结肠腺瘤或结肠癌的诊断意义。结果结肠腺瘤组织中 Hsa-miR-21-5p, H
2、sa-miR-106a-5p的表达水平较瘤旁组织显著增高(p<0.05), Hsa-miR-143-3p的表达水平显著降低(p<0.05)；经病理鉴定癌变的组织中 Hsa-miR-21-5p表达水平显著高于度性瘤组织，差异有统计学意义(p<0.05), 而Hsa-miR-106a-5p的表达水平与良性瘤组织无统计学差异(p>0.05), Hsa-miR-143-3p的表达水平低于良性瘤组织，差异有统计学意义。结论 Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p, Hsa-miR-143-3p 的表达水平对临床诊断结肠腺 瘤及是否发生癌变有指导意义。【关键词
3、】结肠腺瘤；结肠腺癌；miRNA； Hsa-miR-21-5p；Hsa-miR-106a-5p； Hsa-miR-143-3pThe expression and significance Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p, HsamiR-143-3p in colorectal adenomasAbstract Objective Detecting the expression of Hsa-miR-21-Sp, Hsa-miR-106a-5p, Hsa-miR-143-3p in colorectal adenomas and colon adenocarci
4、noma, to investigate their clinical diagnosis significance in colon adenoma and colon adenocarcinoma. Methods Fluorescence quantitative real-time PCR (qRT-PCR) assay were used to detect the expressions of Hsa-miR-143-3p, Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p in colorectal adenoma tissues and Adenomatous ad
5、jacent tissues, further reveal their roles during colon adenoma or colon cancerdiagnosis on the basis of corresponding pathological diagnosis. Results Hsa-miR-21-5p , Hsa-miR-106a-5p expression levels in colorectal adenomas than tumor adjacent tissues was significantly higher (p<0.05), the expres
6、sion level of Hsa-miR-143-3p significantly lower (p<0.05); the expression Hsa-miR-21-5p was significantly higher than benign tumor tissue, the difference was statistically significant (p<0.05), but Hsa-miR-106a-5p was not (p>0.05), Hsa-miR-143-3p expression level lower than benign tumor tis
7、sue, the difference was statistically significant. Conclusion It is meaningful to detect the expression of HsamiR21-5p,HsamiR106a5p, HsamiR-1433p for clinical diagnosis of colorectal adenoma and whether cancerous instructive.Key words Colorectal adenomas； Colorectal adenocarcinoma； miRNA； Hsa-miR-21
8、-5p；Hsa-miR-106a-5p； Hsa-miR-143-3p结肠癌是发病率较高的消化系统恶性肿瘤，其5年生存率很低，结肠腺瘤尤 其是进展期结肠腺瘤是结肠癌的主要癌前病变，早发现早诊断是提高患者生存率 的关键。从腺瘤到结肠癌的演进是一个多基因，多步骤参与的过程，涉及不同基 因序列的畸变和基因表达的改变。miRNAs是一类新的基因调控因子，它在控制 细胞的生长、分化、血管形成及凋亡等过程中发挥着非常重要的作用。随着越来 越多的miRNAs被发现和研究的深入，已证实miRNAs与恶性肿瘤密切相关，相 对于毗邻的正常结肠组织，腺瘤和癌内的miRNA表达代表了早期结肠癌发生的 细胞事件。本研究
9、旨在通过检测 Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p, Hsa-miR-143-3p 的表达水平对结肠腺瘤及是否发生癌变的诊断做出指导。标本采集与方法1 .标本来源与收集收集2012.1-2015.1包头市中心医院32例胃肠外科行手术治疗的患者结肠腺 瘤组织及相对应的距肿瘤病灶边缘2cm瘤旁组织。经病理学鉴定21例患者属于 良性结肠腺瘤，11例属于结肠腺癌。其中男17例，女15例，年龄33-67岁， 平均发病年龄52岁。所有患者在取材术前均未接受放化疗及其他针对肿瘤的特 殊治疗。2.方法2.1结肠腺瘤组织标本：即刻采集新鲜组织后，放于-196C液氮中速冻，并 转存于-80
10、C低温冰箱中。使用 Life technology 的 mirVana? miRNA Isolation Kit 试 剂盒从lOOmg组织中提取总RNA, ThermoND-LITE紫外分光光度计测量总RNA 的纯度及浓度，取5uL进行琼脂糖凝胶电泳观察总RNA条带。2.2 cDNA 合成及 qRT-PCR:cDNA 合成：取 lOOng，总 RNA,应用 NCode?VILO? miRNA cDNA Synthesis Kit （Life technology 公司）进行逆转录,20uL 体系如下：5×Reaction Mix （含 通用逆转录引物）4uL, 10×S
11、uperScript?Enzyme Mix 2uL,总 RNA 2uL（浓度 50ng/uL）, DEPC-treated 水 12uL。反应条件：37C60min, 95C5min 灭火逆转录 酶终止反应。qRT-PCR 检测 miRNA 的表达：使用 Life technology 公司的 SYBER?Select Master Mix,另外试剂盒提供了除上游引物及模板以外的所有反应所需物质，应用 StepOnePlus?Real-Time PCR System 检测 Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p, Hsa-miR-143-3p 的表达水平,20uL 体系如
12、下:SYBER?Select Master Mix（2×） 10uL,上游引物下游通用引物各0.4uL, cDNA模板2uL, RNase-free水7.2uL。 PCR 反应条件如下:50C 2min, 95C 2min, 40 个 PCR 循环（95C 15sec 变性， 60C 15sec退火，72C lmin延伸）并在此程序后加溶解曲线条件:（95C 15sec→60C lmin→95C 15sec）,使用 primer5.0 设计特异性上游引物， 由invitrogen公司合成。上游引物如下表1。采用2-ΔΔCt法计算标本 中
13、miRNA 的表达。ΔCt=Ct （目的基因）-Ct （U6）, ΔΔCt=ΔCt （瘤组织）-ΔCt （瘤旁组织）。瘤旁组织目的基因表达水平为1。同一样本 需设立三个平行对照及一个NTC管（无模板对照）。讨论结肠癌的发生过程比较缓慢，结肠癌患者的生存和预后取决于肿瘤的检出时 间，早期筛查早治疗是提高结肠癌患者5年生存率的关键1。miRNAs是一类进 化保守、短小的（一般17-25 nt）单链非编码RNA,它在控制细胞的生长、分化、 血管形成及凋亡等过程中发挥着非常重要的作用2 o近年随着miRNAs研究的深入，发现大量异常表达的mi
14、RNAs通过调控靶 基因的表达而调节包结肠癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展，研究发现 Hsa-miR-21-5p与多种肿瘤的发生发展息息相关2-6,本研究中Hsa-miR-21-5p的 表达水平在大部分良性结肠腺瘤组织中有升高现象，旦结肠腺癌中升高现象更为 明显，这种现象是否可以提示结肠腺瘤的癌变可能？因本课题的时间限制以及标 本量较小的原因，尚未能对此想法做出验证。实验过程中还发现Hsa-miR-21-5p 的检出难度较Hsa-miR-106a-5p与Hsa-miR-143-3p小，有可能成为早期筛查肿瘤 的常规检测项0oHsa-miR-lO6a-5p的表达水平的检测在消化道肿瘤中居多79,
15、作用同Hsa-miR-21-5p,多以致癌基因的角色为主，本课题研究中并未发现良性 结肠腺瘤与结肠腺癌组织中Hsa-miR-106a-5p的表达存在差异，但与癌旁组织相 比，表达水平的增加均有显著差异，研究中起抑癌基因作用的Hsa-miR-143-3p 的表达水平在结肠腺癌组织中明显降低，与Vlastimil Kulda,Slaby。等10-12的研 究结果相似,但我们另外对结肠腺癌与良性结肠腺瘤在Hsa-miR-143-3p的表达水 平上做了比较，发现结肠腺癌的表达水平显著低于良性结肠腺瘤，且部分TNM 分期为N3, MO, Ml期的结肠腺癌患者癌组织中Hsa-miR-143-3p的表达使用
16、 qRT-PCR技术检出难度非常大。综上，在结肠腺癌组织中的Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-143-3p表达水平与良性 结肠腺瘤差异有统计学意义，可作为区分良恶性的指标。结肠癌组织中 Hsa-miR-106a-5p的表达水平显著高于癌旁组织，虽与良性结肠腺瘤无法区分， 亦可作为结肠癌患者的辅助检查项目。相信随着研究的深入高新科技的普及，会 有很多差异表达的miRNA用于肿瘤的早期诊断与预后分析。参考文献1 张观坡，柏愚，李兆申.结直肠癌早期诊断的分子生物学研究进展J国 际消化病杂志，2015, 35 (4)： 247-250.2 Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancersJ. Nat Rev Cancer, 2006, 6(11): 857-866.3 娄艳辉.miRNA-21调节抑癌基因PTEN参与卵巢癌发
