《基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟豚耐药性作者：张瑞梅，刘成永.申淅刘汀 作者单位：江苏省徐州市传染病医院结核牝221004【摘要】 目的研究基因芯片在检测结核分枝杆曲对利福平和异烟M耐匆性中的应用方法根据与利福平和异烟腓耐约相关的4 条基因上的11个位点和30种单核苜酸多态性设计制作芯片，用芯片检测结核分枝杆菌的基因突变，从而判断其耐为性。结果用基因芯 片在110株异烟腓耐药株中检测出85侏(73.3%)，在30株异烟腓敏感株中检测出22株(73.3%),在94株利福平耐药株中检测出 77株(81.9%),在46株利福平敏感株中检测出40株(87.0%)。芯片检厕结果与部分样本的通序结果
2、完全相符。结论用DNA芯片 检测结核分技杆菌对利福平和异烟脐的耐药性具有较高的特异性和敏感性，该法快速、精确,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检泌。关键词】 寡核甘酸序列分析分枝杆曲姑核药物耐受性The use of gene chip in detecting mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin and isoniazidZHANG Rui mei, LIU Cheng yong, SHEN Tao, et al.(Xuzhou Infectious HospitaL Jiangsu 221004. China)Abstract
3、Objective To study the application of gene chip in detecting mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin(RFP) and isoniazid(INH).M e t h o d s Probes were designed and the gene chip was fabricated according to the 30 single nucleotide polymorphisms and 11 mutations on 4 genes associated with R
4、FP and INH resistance.The mutations in mycobacterium tuberculosis were detected by the gene chip to analyze the resistance to INH ang RFP. Results 85 of 110(73.3%) strains resistant to INH and 22 of 30(73.3%) strains sensitive to INH were detected;while 77 of 94 (81.9%) strains resistant to RFP and
5、40 of 46(87.0%) strains sensitive to RFP were detected.The results from the gene chip detection were consistent with some of the sequence information. C o n c 1 u s i o n The gene chip technology?a fast detection with high accuracy,specificity and sensitivity,as shown in our studyjs promising in the
6、 clinical detection of mycobacterium tuberculosis resistance to INH and RFP.Key words Oligonucleotide array sequence analysis； Mycobacterium,tuberculosis； Drug resistance目前，用于结核分枝杆菌耐药性的检测方法布很多种，但大部分检测方法所需时间都较长11,以培养为基础的绝对浓度法或比例 法,需要23个月时间才能得到药敏结果，放射性快速诊断技术(BACTEC)法可将耐药检测缩短到24周，但仍不能满足临床的需 要。因此.创建快速、简
7、便、准确的检测方法就成为基础研究领域的一个重要课题，基因芯片是近年发展起来的-种新方法。基因芯片 检测结核分枝杆前基利用结核分枝杆前耐药性与基因突变有关的分r机制，对其与耐药性相关的突变热点进行检删，根据检测位点的突 变情况判断结核分枝杆曲的耐前性，将耐前性检测的时间缩短到34h,达到快速、灵敏、准确检测耐药性的目的。本研究畏据利福平 (RFP)和异烟脱(INH)耐约与基因突变有关的分子机制，制备检测突变位点的基因芯片，用基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平 和异烟脐的耐药情况，并与绝对浓度法药敏结果进行比较。1材料与方法1.1材料(1检测前株：结核分枝杆菌临床分离株140株,其中46株为RF
8、P敏感株，94株为RFP耐药株,30株为INH敏感 株，110株为INH耐药株,70株为RFP和INH同时耐药株,6株为RFP和INH同时敏感株,以上菌株均为我院菌株库标本,所有菌株 皆通过绝对浓度法约敏检测。(2)芯片制作及检测设备：芯片制作所需芯片、点样仪及激光共聚焦扫描仪等设备均由中科院上海微系统 与信息技术研究所提供。芯片上所有探针及PCR扩熠引物均由上海博亚生物技术公司合成。1.2方法(1) DNA制备：采用本实验室自制的标本前处理试剂盒提取所有菌株的染色体DNA置4C保存。(2)引物设计：设 计4对引物，分别扩增rpoB、ahpC, inhA及.katG4个基因的部分片断，每条片断
9、均包含各|基因上的检测位点。(3)芯片制备：针 对rpoB基因511、512、516、514、526、531位点，ahpC基因启动子区域的6、 10位，inhA启动子orfl阅读框前15、 8位， 以及katG基因315位的野生型和不同突变型共同设计探针2-7,芯片制作方法见参考文献8。(4)检测过程：参见参考文献2 。(5)序列测定:随机抽取编号为150的扩增后和5株芯片检测结果无信号的DNA样品,以及所有敏感株中检测到突变基因 的DNA样品，送上海基康(GeneCore)生物技术有限公司进行测序。2结果2.1 INH耐药株的检测结果在110株INH耐药株中,22株芯片检测结果为敏感株,85
10、株芯片检测结果为突变株，总突变率为77.3%, 基保75株发生katG突变：17株发生inhA突变:3株发生ahpC突变。其中9株同时发生katG和inhA突变；1株同时发生katG和ahpC 突变。另各有2株在芯片inhA位点（其中1株katG位已检测到突变）和ahpC位点无信号，经测序发现芯片上无信号处的2条inhA基 因和2条ahpC基因分别发生了芯片上没有包含的突变。22 INH敏感株的检测结果 在30株INH敏感株中,芯片检测出8株突变，突变率为26.7%，其中katG突变1株、inhA突变7 株。2.3 RFP耐药株的检测结果 在94株RFP耐药株中，用芯片检测到77株突为株，突变
11、率为81.9%，其中38株531位突变，25 株526位突变，7株516位突变,7株511位突变，5株513位突变,1株514位突变。其中511位和516位同时发生突变的有3株, 511位和526位同时发生突变的有1株，511位和531位同时发生突变的1株，513位和526位同时发生突变的1株。另外有1株526 位无信号，经测序证明，526位发生了芯片上没有的新的突变。2.4 RFP敏感株的检测结果 用芯片检测46株RFP敏感株，检迥到6株发生突变，突变率为13.0%,其中4株为531位突变，1 株为526位突变，1株为511位突变。2.5洲序结果所有测序结果均与芯片检测结果相同。3讨论本研究
12、用芯片可以检测出77.3%的INH耐约性萌株，katG、inhA、ahpC3个基因的总突变率为77.3%,低于国内外文献报道的突变 率1, 9 , katG的突变率为68.2%.与我们目前现有报道的katG突变率为50%70%基本相符1011。inhA突变率高于国内 文献12的报道，但是凡乎所有的inhA和katG同时突变株都是INH高耐药询株。而66.7%的inhA单独突变耐药株则为INH低度耐 药，这也说明了在结核分枝杆菌的分子耐药机制中，inhA突变可能是引起INH耐药性的-个因素，但不一定是主要因素，inhA突变主要 是与katG突变一起产生协同耐约。ahpC突变率则低于国内外文献的报
13、道，但.是从检测结果看，不论是ahpC单独突变还是和katG同时 突变，凡是ahpC突变株都是INH高耐约株，这说明ahpC突变可能也是INH耐前分子机制的-个重要部分。但在所有的检测株中没有 发现katG完全缺失的现象，这与近期文献报道相符7, 101 在芯片检测INH敏感株中，存在26.7%的突变率，虽然这个突变率高于国内外报道的突变率，但是从上述结果看，突变主要集中发 生在单的inhA中，与在INH耐药株中发生inhA突变的耐约怫况合并分析可以看出，单独的inhA突变并不一定会导致耐药，大多数情 况卜KJ使导致耐约也只是低度耐约，所以不能识独根据inhA的突变情况对结核分枝杆南的INH耐
14、约性进行判断，应同时结合katG的突 变情况进行分析。本研究中用芯片可以检测的81.9%的rpoB突变.比文献报道10, 1214的中瞻 突变率低,因为本研究中检测的只是rpoB 81 bp的中心区域编码的27个氛基酸位点的6个位点，并没有完全覆盖所有的27个位点的81个碱建。另外结核分枝杆菌各位点突变率的 高低受地域影响比较大，所以本实验检测到81.9%的突变率也是合理的。本研究中在13.0%的RFP敏感株中检测到突变，这在目前的报道中尚少见，但存在rpoB突变的菌株中有5株为INH耐药株，1株 为SM耐药株，这说明rpoB与INH和SM耐药之间可能存在某种关联，rpoB与INH耐匆之间的关
15、系已有文献报道.另外rpoB突变在 RFP敏感株中的存在，也可能是由其他未知的机制所致，所以rpoB突变与RFP耐约性之间可能有更深的关联机制，有待于进步研究。 另外在检测INH和RFP敏感株时出现较高的突变率，也可能是绝对浓度法中药物浓度较高，绝对浓度法检测为敏感株的菌株在更低药物 浓度卜可能表现耐药.在这些低浓度耐药株中出现突变也是可能的。虽然在突变位点和耐药的关系中仍有很多尚待进-步研究解决的问题，但是芯片对所有结核分杆腐网株的检测经测序证明100%是准 确无误的，而且从最初的南株基因组的提取至最后街到耐药变率结果，仅需4 h,对结核分枝杆菌INH耐药株曲敏感株的RFP耐药株与 敏感株检
16、测的准确率分则达到77.3%. 73.3%和81.9%、87.0%,这充分证明了用芯片检测结核分枝杆菌基因突变具有快速、灵敏.高 效及特异的特点。用基因芯片12经可以成功地检测结核分枝杆萌4条基因11个位点的30种单.核甘酸多态性，这是到I I前为止其他检测 基因突变方法所无法达到的，可以应用于结核分枝杆圈耐药性的临床检测。【参考文献】1 李国利.分枝杆菌药物敏感性试验A涨敦荣，主编.现代结核病学M.北京:人民军医出版社,200.36 57.3 Piatek ASJelenti A,Murray MR,et al.Genotypic analysis of Mycobacterium tuberculosis in two distinct populations using molecular beacons:implications for rapid susceptib
