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1、目,录,乳酸链球菌素的分子结构,乳酸链球菌素（Nisin）亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是目前最常用的生物防腐剂，它是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成。分子式为C143H228N42037S7，分子量为3510。Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，分别为氨基丁酸(ABA)、脱氢丙氢酸(DHA),R一甲基脱氢丙氨酸(DHB)、羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)和已一甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)，它们通过硫醚键形成五个内环，其活性体为二聚体或四聚体。到目前为止，已发现Nisin分子的类型有A,B,C,D,E和Z，其中以NisinA和Z两种类型的研究较多。NisinA与
2、NisinZ的差异仅在于第27位氨基酸的种类不同。前者为组氨酸(His)，后者为天冬酸胺(Asn)，其抗菌特性几乎无差别。,4,乳酸链球菌素的性质,Nisin的溶解性、稳定性都与溶液的pH值密切相关。Nisin的溶解度随pH值的下降而提高，pH值25时溶解度为12，pH值为50时下降至1J4，在中性及碱性条件下几乎不溶解。实验结果表明，Nisin在酸性条件下极为稳定，pH20条件下可耐受高温处理(121，15min)，而无活力损失，而在中性或碱性条件下即发生失活。,物理和化学性质,生物学特性,当d一胰蛋白酶、胰酶制剂和枯草杆菌肽作用Nisin后，会使其失去活性，但羧肽酶A、羧肽酶E、肠肽酶、胃
3、蛋白酶和胰蛋白酶对Nisin无作用。Hurst报道，Nisin对凝乳蛋白酶、胰酶消化酶、唾液酶等很敏感，但对粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏感，在酸性条件下，100、10min链酶蛋白酶不敏感。,乳酸链球菌素的抑菌谱,Nisin抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长和繁殖.如葡萄球菌属、链球菌属以及梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显,在一定条件下，如冷冻、加热、降低pH值、EDTA处理等，乳酸链球菌素亦可抑制一些革兰阴性菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长。,乳酸链球菌素的抑菌机理,Nisin的抑菌机理是近年来的研究热点之一，并不断取得突破。其
4、抑菌作用主要是杀菌，而非抑菌或溶菌。Nisin对营养细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖等的生物合成，使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，引起细胞裂解。,乳酸链球菌素的遗传学研究,编码Nisin的遗传密码的确切位置有两种理论，一种认为它与质粒连锁，另一种则认为是在染色体上。支持前一种观点的主要证据有：1947年，Kozak研究产Nisin菌株的突变现象时发现，若先以原黄素或溴乙啶诱变并进行高温处理，再以NTG进行诱变，未检测到回复突变株。并据此推测Nisin基因可能位于质粒上。进一步研究发现，Nisin的产生与一个17.5MDa的质粒有关。1991年，Kal
5、etta和Entian从乳酸链球菌素6F3的质粒中成功克隆到了编码Nisin的结构基因。,乳酸链球菌素的遗传学研究,但是另一些研究者认为Nisin基冈位于染色体上，并有实验证明一些产Nisin的菌株并不存在质粒IIII。对Nisin基因定位的研究最近取得的一些突破性进展，一些研究者根据对染色体的缺失与杂交实验提出Nisin结构基凶与染色体上的一个可接合转移的转座子有关。Horn等人则提出Nisin基因存在于一个70kb大小的转座子Tn5301巾，同时另一些研究者的工作也证实了这个转座子的存在，且发现Nisin基座是不稳定的。这些发现可能提示我Nisin基因位于一个可转座于质粒和染色体上的转座子
6、巾，在不同的菌株中Nisin基因的位置不一定相同。1988年，Nisin基因首次被克隆出来。不同于大部分的多肽类抗生素。Nisin前体蛋白是由核糖体合成，经过一系列包括脱水、硫环形成等复杂的翻译后加工过程，最终形成有活性的成熟Nisin分子110I。对Nisin遗传学研究的深入，将使我们有可能定向改变Nisin的溶解度、稳定性、抑菌范围等，对于Nisin的应用前景有着重大而深远的意义。,乳酸链球菌产生菌的筛选,目前主要是利用产生菌中乳酸链球菌素前体基因和其抗性基因以及蔗糖发酵基因内紧密连锁的原理，在添加有乳酸链球菌素、蔗糖及澳甲酚紫的选择培养基上,从牛乳中筛选产生菌。 另外,也报道了通过一培养
7、基中溶钙圈直径大小筛选产生菌株的方法。,乳酸链球的发酵生产,以乳酸乳球菌乳酸亚种作为生产菌株发酵生产。通过改变培养条件参数进一步提高产量,如碳源、氮源、温度、接种量等。以对培养基改良的研究居多。对营养要求与产量关系的研究有助于了解生物合成的途径和调控方式。,发酵产物的提取工艺,有机溶剂法分离提纯乳酸链球菌素是最简便的一种方法。Marttik向乳酸乳球菌发酵液中加入氯仿,搅拌后静置,吸取乳浊液层,加入乙醇,产生含有Nisin的沉淀物,0.05mol/L HCI溶解沉淀,再用乙醇沉淀,最后干燥沉淀。这种方法得到的Nisin活力为2.0106 IU/g,纯度为5%。该方法步骤繁琐,产物纯度低。,利用
8、菌体对乳酸链球菌在高pH吸附，低pH解吸附的特性，构建一种固定化细胞柱，将含乳酸链球菌的粗品通过固定化细胞，乳酸链球菌就被吸附从而达到分离浓缩的目的。,有机溶剂法,柱层析法,吸附法,该法 是用aD10杂交瘤细酸胞制备乳酸链球菌的单克隆抗体，并将其通过N-羟基琥珀亚胺葡萄糖柱，在一定条件下抗体与葡萄糖偶联，然后将乳酸链球菌发酵液除菌后进行柱层析。,乳酸链球菌素的活性测定,在啤酒酿造中的应用,腐败乳酸菌对Nisin敏感，但酵母几乎不受其影啊，因此Nisin可与酵母一起在生产啤酒、果酒、烈性乙醇等酒精饮料时加入。,啤酒酿造中添加 Nisin 的作用有以下几点：,在肉制品中的应用,肉制品如低温肉制品、
9、高温肉制品等营养特别丰富、极易腐败变质，添加一定量的 Nisin 可阻止芽孢的生长及其毒素的产生，同时还可降低食盐及磷酸盐的用量，使保存期可延长一倍以上。,在低温肉制品中的应用,Nisin 用于低温肉制品中的保鲜是非常有效的。在世界许多国家，肉制品的生产和消费要经过长时间运输与贮藏，在产品中加入 Nisin，以延长低温肉制品的保质期。有研究表明，在低温肉制品如盐水方腿、维也纳香肠等中加入 11.5g/kg 的 Nisin，再复合一定量的双乙酸钠可以有效的抑制产品中细菌和霉菌的生长与繁殖，显著提高了保鲜效果，有效的延长了产品货架期。,在高温肉制品中的应用,肉制品属高水分食品，各种微生物都能生长。
10、特别是经过高温处理的肉制品，其中的大部分微生物均被杀灭，但仍会残存有少量的对热有极强抗性的芽孢菌，此外由于高温肉制品均经过高温灭菌后在常温中进行流通与储存销售，如果不加入部分能够抑制芽孢类细菌的 Nisin，芽孢类细菌萌发繁殖，极易导致产品败坏，影响食品安全.在高温肉制品中添加少量的 Nisin，可有效的保障高温肉制品的安全水平。,在乳制品中的应用,牛乳富含各种营养成分，深受人们喜爱。但牛乳及其制品在生产、加工、贮运、消费的过程中，极易受各种微生物的污染。由于乳制品特性不同，污染的微生物种类和数量差异也很大，乳制品保藏的问题始终是乳制品加工者首要解决的问题。,巴氏杀菌乳中的应用,巴氏杀菌乳采用
11、巴氏杀菌工艺生产，只能杀死致病微生物，但仍含有能影响产品风味、引起产品变质的其它微生物，所以其保质期一般都较短，且需要冷藏。在巴氏杀菌乳中添加乳酸菌素可以对革兰氏阳性菌起到抑制作用，从而延长产品的保质期并使其在常温下保存。经试验证实，加入3050 IU/mL的乳酸菌素可以使鲜奶货架期延长一倍。,Nisin应用于酸奶中，主要目的不是为了防腐，而是为了抑制后酸。酸奶因其低pH值的特点，污染菌主要是霉菌和酵母菌，Nisin对其无抑制作用，所以不能防止酸奶长毛和鼓盖现象。后酸是影响酸奶保质期的一个主要因素，尤其是在现有的冷链条件下，我国酸奶的运输、贮藏和销售还没有完全实现全程冷链，所以后酸问题尤为突出
12、。在酸奶中添加Nisin，可以有效地抑制酸奶中的保加利亚乳杆菌。当Nisin添加量为60 IU/mL时，可抑制酸奶的后酸化，对酸奶的黏度、酸菌活菌数无明显影响。,在酸奶中的应用,Nisin作为一种高效、无毒的天然食品防腐剂符合未来食品防腐剂的发展要求。它可广泛地应用于食品，特别是需经热处理的食品中，不但有较好的防腐抑菌作用，而且能减弱热处理强度，从而降低加工成本,改善风味、外观。 Nisin用于食品防腐时，会受到- .些因素的影响，导致其抑菌能力下降。 例如在未经热加工或经简单热加工的食品中，来源于微生物、植物或动物有机体的蛋白酶在食品货架期内可使Nisin降解。 传统化学防腐剂如苯甲酸及其盐
13、、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类等对于人体的危害正在引起世界各国的重视,其使用范围与剂量也正在受到越来越严格的控制。而以乳酸链球菌素为代表的生物防腐剂因其高效、安全、无毒无残留等特点正在受到全球市场的青睐,大有逐渐替代化学防腐剂的趋势。,乳酸链球菌素是一种多肽，人体食人后可被胃蛋白酶迅速分解为氨基酸，被人体吸收，不会改变人体肠道内正常菌群的存活，亦不会象抗生素-样产生交叉抗性。乳酸链球菌素作为防腐剂添加于食品中，不会对食品的色、香、味、口感产生副作用。乳酸链球菌素的使用可降低食品的杀菌温度、减少热处理时间，从而保持食品的良好风味和营养价值，并节省能源，提高工作效率。乳酸链球菌素的酸热稳定性和低
14、温贮藏稳定性，有利于持久发挥其防腐效果，延长食品的保质期和货架期。乳酸链球菌素与热处理杀菌相结合，可大大提高腐败菌对热的敏感性，尤其是芽抱。然而，作为食品防腐、保鲜剂的乳酸链球菌素存在着抗菌谱窄、只对G+菌有作用，对G-致病菌、酵母、霉菌及病毒无效等缺点。,我国作为一个幅员辽阔、资源丰富的发展中国家,用于发展生物防腐剂产业的原料资源丰富且价格低廉,而且人力资源与成本也较发达国家具有明显的优势。再加上近年来国家对于食品添加剂行业以及生物制造产业的政策上的大力支持,为发展乳酸链球菌素产业发展提供了诸多有利因素。随着Nisin应用范围与应用程度的不断拓展,国内生产企业在发酵工艺提取工艺、质量管理、应用研究等方面不断提高技术水平，以及行业监督、管理制度的不断完善,该产业仍将具有巨大的发展空间与市场前景。 使Nisin 发挥最佳作用的是液体和均一性的食品，对固体和异质性食品作用较差。在固体和异质性食品中需要适当增加Nisin的使用量。若将Nisin配制成复配型防腐剂,可发挥广谱抑菌作用。孙京新等将Nisin和乳酸钠联合加于西式火腿中，结果表明，二者联合使用，保质期比单独使用Nisin ;长，并且降低了亚硝酸盐的含量。刘喜荣等通过对Nisin在延长豆奶保质期方面的研究表明，Nisin与某些盐类复合使用要比Nisin单独使用效果好。由单一型向复配型防腐剂转变，Nisin的应用前景将更为广阔。,
