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1、EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立 【摘要】 目的 构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro2A，脂质体法将pMSCVpuro2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RTPCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果 限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体
2、；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3.2107 CFU/L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论 携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67LMP2A。【关键词】 疱疹病毒4型 人 逆转录病毒 潜伏膜蛋白2A PT67细胞系ABSTRACTObjectiveTo establish a retroviral vector encoding EpsteinBarr virus (EBV) latent membrane protein 2A(LMP2
3、A) and a stable virus producing cell line.MethodsThe target gene LMP2A amplified by RTPCR was subcloned into retroviral vector pMSCVpuro. The recombinant plasmid pMSCVpuro2A was transfected into packaging cell PT67 by lipofectamine 2000. The transfectants were selected by puromycin and viral titer t
4、ested. The expression of LMP2A in PT67 cell line was identified by RTPCR. ResultsThe recombinant retroviral vector pMSCVpuro2A was identified by polymerase chain reaction (PCR), restrictive analysis, and DNA sequencing. A stable virus producing cell line was selected and the viral titer was 3.2107 C
5、FUL. The expected 1 500 bp fragment was amplified from PT67LMP2A cells，this result indicated that LMP2A could effectively express in packaging cell PT67. ConclusionThe recombinant retroviral vector pMSCVpuro2A was constructed successfully. A stable viral producing cell line PT67LMP2A was selected an
6、d established. This study established a foundation for further study of LMP2A. KEY WORDSherpesvirus 4, human; retrovirus; latent membrane protein 2A; PT67 cell line EB病毒(EBV)属人类亚科疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体，与鼻咽癌(NPC)、Burkitts淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。潜伏膜蛋白基因2A (LMP2A)是EBV潜伏期膜蛋白的一种,在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中均能检测
7、出LMP2A，并且是NPC、BL等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一，提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏，并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用。由于LMP2A分子具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用，因此越来越多的研究表明，LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。但LMP2A的生物学功能尚不清楚，为深入研究LMP2A的生物学活性，本研究通过逆转录病毒载体介导LMP2A基因的转移，旨在建立能稳定产生携带LMP2A基因的逆转录病毒的产毒细胞系PT67LMP2A。 1 材料和方法 1.1 主要材料和试剂 Bgl、EcoR及T4 DNA 连接酶购自TaKaR
8、a公司；脂质体转染试剂lipofectamine 2000和嘌呤霉素(puromycin)购自美国Invitrogene公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；胎牛血清 购自杭州四季青公司；携带嘌呤霉素抗性基因(puro)的pMSCVpuro质粒系中国海洋大学于文功教授惠赠；工程菌Ecoli.JM109为本实验室保存菌种。 1.2 细胞 逆转录病毒包装细胞PT67购自中国武汉典型培养物保藏中心，用含体积分数0.10的胎牛血清、100 kU/L的青霉素、100 g/L链霉素的DMEM，于37 体积分数0.05的CO2培养箱中培养。 1.3 逆转录病毒的制备 1.3.1 引物设计和目的
9、基因的制备 根据GenBank提供的LMP2A基因编码序列，DNAstar软件设计扩增EBV LMP2A读码框架的特异性引物，并在上游引物和下游引物的5端分别引入Bgl和EcoR酶切位点和保护碱基。其上游引物序列为：5GGCAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGGTG3,下游引物序列为： 5CGGAATTCTTATACAGTGTTGCGATATGG3，扩增产物的长度为1 500 bp。用TRIzol法提取EBV阳性LCL细胞总RNA，按照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR模板,扩增产物于12 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外线透射仪下观察结果。 1.3.2 逆转录病毒表达载
10、体pMSCVpuro2A的构建 用Bgl和EcoR双酶切LMP2A的PCR产物和质粒pMSCVpuro，纯化后连接形成重组质粒pMSCVpuro2A，导入工程菌Ecoli.JM109中扩增，提取重组质粒。通过PCR、限制性酶切和测序分析进行鉴定。同时，以不含目的基因LMP2A的质粒pMSCVpuro作为载体对照。 1.3.3 重组逆转录病毒的包装及阳性克隆的筛选 常规培养包装细胞PT67达7080汇合时，采用脂质体法转染重组质粒pMSCVpuro2A，具体操作参照lipofectamine 2000说明进行。转染48 h后以110传代，待细胞贴壁后加嘌呤霉素至终质量浓度10 mg/L进行筛选。
11、约10 d后可见阳性克隆出现，分别选取细胞克隆扩大培养，获得产毒细胞系PT67LMP2A。收集细胞培养上清，用0.45 nm的滤器过滤后，置-70 冰箱保存备用，所获病毒命名为vMSCV2A,载体对照命名为vMSCV,采用NIH3T3细胞测定重组逆转录病毒的滴度。 1.3.4 病毒滴度的测定 制备含量为5109/L的NIH3T3单细胞悬液，感染前1 d接种于6孔细胞培养板。24 h后细胞达40%50%时吸去原培养基，加入不同稀释度的含体积分数0.05血清的病毒上清（从10-1开始倍比稀释至10-6）。每孔加polybrene(8 mg/L)作用3 h以降低膜表面电荷，促进逆转录病毒感染细胞，然
12、后补加培养基3 mL至polybrene的终质量浓度为2 mg/L。继续培养48 h，使用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化单层细胞，以15传代至6孔板。24 h后加入含puromycin(10 mg/L)的选择性培养基，每23 d换液1次。56 d后，降低嘌呤霉素浓度（5 mg/L）继续维持培养，直到阳性克隆形成（约为23周），显微镜下进行计数。公式为：病毒滴度（CFU/mL）=平均抗性细胞克隆稀释倍数1 000。 1.3.5 RTPCR检测LMP2A的表达 分别提取转染重组质粒pMSCVpuro2A和载体对照质粒的PT67抗性细胞克隆总RNA，用DNase消化处理排除DNA的干扰，RTPCR扩
13、增目的基因LMP2A。同时以DNase消化处理的RNA为模板进行PCR检测，证实RNA中确实无DNA污染,以EBV阳性的LCL作为阳性对照，PCR产物于12 g/L琼脂糖凝胶中电泳观察结果。 2 结 果 2.1 重组质粒pMSCVpuro2A的鉴定 EcoR和Bgl双酶切产物电泳可观察到约6.3 kb和1 500 bp的DNA条带；PCR扩增出大小约1 500 bp的条带，与预期结果相符，结果见图1。正反双向测序结果显示重组质粒目的基因插入方向正确，核酸序列准确无误，读码框架完整。 图1 重组质粒pMSCVpuro2A的鉴定 :Marker DL15000;:Bgl和EcoR双酶切重组质粒pM
14、SCVpuro2A;:Bgl单酶切重组质粒pMSCVpuro2A;:阳性对照(EBV阳性LCL);:pMSCVpuro2A的PCR扩增产物;:pMSCVpuro PCR扩增产物 2.2 阳性克隆的筛选 重组质粒转染PT67细胞后，加嘌呤霉素筛选抗性细胞克隆，每2 d换液1次，筛选至第5天出现大量细胞死亡，第8天时可观察到由数个细胞组成的阳性克隆，未转染重组质粒的对照细胞则几乎全部死亡。当细胞长至7080汇合时，换半量不含嘌呤霉素的完全培养基，每24 h收取培养液上清为病毒原液。 2.3 逆转录病毒滴度测定 收集含有逆转录病毒的上清液感染NIH3T3细胞测定病毒滴度，得到逆转录病毒vMSCV2A
15、的病毒滴度为3.2107 CFUL。 2.4 重组逆转录病毒的RTPCR鉴定 提取PT67LMP2A总RNA,RTPCR产物琼脂糖电泳显示特异性1 500 bp预计大小的片段，表明重组腺病毒在293细胞能有效转录(图2)。 3 讨 论 EBV对宿主细胞的感染可分为潜伏感染和裂解感染两种类型，EBV相关肿瘤组织中病毒主要以潜伏感染的形式存在1。由于在EBV相关肿瘤组织中，EBV只感染癌细胞而不感染正常细胞，使得靶向基因治疗有可能通过EBV而实现。采用免疫学方法治疗EBV相关肿瘤是近年来倍受关注的焦点。应用EBV某种基因表达载体转染抗原提呈细胞(APC)如树突状细胞(DC)等，可以诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤EBV阳性肿瘤细胞起到抗肿瘤作用，目前此类研究仅局限于体外实验2，3。鉴于EBV在肿瘤组织中多以潜伏感染的形式存在，故EBV核抗原（EBNAs）和潜伏膜蛋白（LMP1和LMP2）基因是可以被采用的靶基因。在EBNA1分子中含有丰富的甘氨酸丙氨酸重复序列，可以影响HLA类分子对其的处理和递呈；LMP1是重要的转化基因，其编码蛋白和EBV细胞转化功能密切相关，因此两者都不适于作为EBV相关肿瘤免疫治疗研究
