生化分离工程实验课件

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1、生化分离工程实验 指导老师：何 进 教 授 电子邮箱： 联系电话： 助教学生： 赵有文 刘 舒 胡轶敏 危雅乐 yale. 1组 李佳佳（组长） 董奇峰 吴婷婷 杨后召 2组 范文瑾（组长） 谢贻天 熊雅琪 罗文 3组 刘小翠（组长） 张箐 郑琦 孟庆 4组 罗云超（组长） 刘浩宇 黄玮 李智 5组 唐清（组长） 李斌 严楠峰 柴芝培 6组 白腾龙（组长） 伍良伟 余乐 裴媛筠 7组 邹铮铮（组长） 刘娟 尹学琳 王海云 8组 赵鹏（组长） 张灵芬 潘丽娜 余晓岚 菌株的优化培养 总DNA或RNA的抽提 PCR或RT-PCR扩增目的基因 乙醇沉淀回收线性化片断 大肠杆菌表达载体pET-28 酶

2、连产物转化E.coli DH5 挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证) 检索感兴趣的基因 （hfq/fabz） 直 接 优 化 并 合 成 连T载测序 重组表达质粒转化E.coli BL21 挑取重组子, 用菌落PCR方法验证 IPTG诱导促使目的大量蛋白表达 细胞破碎及蛋白抽提 目标蛋白的纯化 蛋白质浓度测定-Bradford法 目标蛋白的鉴定Western biotting 结晶 结构解析 本次试验内容 本次试验的主要内容 vHis-Tag系统 vpMAL系统 无细胞体系 目的基因的背景资料 vHfqvfabZ Hfq是一个高度保守 的RNA结合蛋白，最 初被发现是作为大肠

3、杆菌RNA噬菌体Q 复制所必需的管家因 子。现在则被认为是 细菌基因转录后调控 的关键因子，广泛参 与细菌多种生命活动 的调控。 大肠杆菌fabZ基因编 码3-羟基脂酰ACP脱 水酶，是大肠杆菌中 的必须基因，该基因 的突变会导致细菌细 胞的死亡。 生化分离工程实验（星期五） 一，接种 按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养 基中 ,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放 于第八组台面。 系统His-Tag系统pMAL系统 菌株编号HAZJH022 宿主菌大肠杆菌BL21大肠杆菌DH5 目的基因hfqfabZ 培养基LB培养基LB培养基 接种量1%（2 ml）1%（2 ml

4、） 加入抗生素Kan（200 ul）Amp（200 ul) 生化分离工程实验（星期五） 将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200 l于 1.5 ml离心管中，10000 rpm/min离心1 min，弃上 清，加入200 l的无菌水洗涤菌体上残留的培养基 10000 rpm/min离心1 min，弃上清，然后重悬于40 l灭过菌的去离子水中，100 煮15 min， 10000 rpm/min离心1 min，取上清9.2 l作为菌落PCR的 模板。 二，菌液PCR （验证目的基因已转入宿主菌中） PCR体系 H2O 9.2 l 10 X PCR buffer 2.5 l dNTP 2 .0

5、l 上游引物 0.5 l 下游引物 0.5 l Taq酶 0.3 l 模板 10 l 总体积 25 l PCR程序 95 5 min 95 35 s 56 40 s 72 60 s 72 10 min 25 10 min Cycle 30 注：用质粒做阳性对照，水做阴性对照，不用重复， PCR管上做好标记！ The pMAL-c2 series of vectors have an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. The

6、pMAL-p2 series of vectors contain the normal malE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic membrane, and the fusion proteins can be exported to the periplasm 表达系统His-TagpMAL 菌株HAZJH022 培养温度3737 转速200 rpm/min200 rpm/min 适宜状态OD600=0.6OD600=0.5 所需时间2.5 h2.5 h 加入IPTG的终浓

7、度 1.0 mM (2 ml) 0.3 mM (0.6 ml) 三，诱导 注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1 ml于1.5 ml的离 心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导前”，放于 第八组桌面的离心管板中，于20 保存。 四，配试剂 五，PCR结果 依据每组发的纸条进行 生化分离工程实验（星期五 ） 将加入诱导剂后的菌液再放入37 200 rpm/min的摇 床中诱导培养4-5小时后收集菌体。 菌株HAZJH022 沉淀 （离心管对应配平 ） 8000 rpm/mim 离心5 min 8000 rpm/mim 离心5 min 收菌弃上清，沉淀用 10ml binding buffe

8、r重悬 弃上清，沉淀用 10ml column buffer重悬 保存2020 注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1 ml于1.5 ml的离心管中，做好标记（ 组号，菌液名）记作“诱导后” 放在第八组的离心管板上。 离心时用天平严格配平，沉淀重悬后做好标记放于第八组桌面上！ 六，收菌 组氨酸和Ni-NTA imidazole 亲和作用原理 6His/Ni-NTA亲和纯化步骤 系统原理示意图 pMAL Ni柱的清洗与保存 用水洗3次（去掉保存的20%乙醇） 充电（装满NiSO4，温和摇动后自然沉降 ） 洗涤（3次水洗，去掉游离的Ni) 平衡（2次的binding buffer洗） HisTag 蛋白质

9、的纯化步骤 上样（每次15ml，样品要与柱子充分结合） 加washing buffer（用100%TCA检测不出沉 淀为止） 加 Elution buffer （一般收集8ml） 重复第48步 第 1步：2倍体积 6 M 盐酸胍，0.2 M醋酸 第 2步：2倍体积水 第 3步：1倍体积 2% SDS（注意低温容易析 出） 第 4步：1倍体积 25%乙醇 第 5步：1 倍体积 50%乙醇 第 6步：1 倍体积 75%乙醇 第 7步：5 倍体积 100%乙醇 第 8步：1倍体积 75%乙醇 第 9步：1倍体积 50%乙醇 第 10步：1倍体积 25%乙醇 第 11步：1倍体积水 第 12步：5倍体

10、积 100 mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍体积水 由于 EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同 蛋白时应另换 HisBind 树脂。 树脂的再生 当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色， 则树脂需要更彻底的清洗处理。 直链淀粉柱的再生 水3倍柱体积 0.1%SDS3倍柱体积 水1倍柱体积 Column buffer3倍柱体积 生化分离工程实验（星期六） 一、裂解细胞 将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎 至菌液成澄清（ 200-300w超声610s-10s，约 20 min）,天平严格配平后10000*g， 4，离 心20 min

11、。上清取1 ml于1.5 ml离心管中，作标 记为“上清”，沉淀用1 ml对应的buffer（his-tag 为binding buffer，pMAL为column buffer）重悬 后，保存在1.5 ml的离心管中，标记为“沉淀” ，做好组号和菌株标记后，放于第八组台面。 二，蛋白纯化 系统His-Tag系统pMAL系统 柱子类型Ni-NTA柱支链淀粉柱 操作方法 3次binding buffer平 衡 3次column buffer平 衡 堵住下端后上样（ 10ml）静止5 min，盛 接流出液后再上样，重 复三次 上样（10 ml）静止 5min，盛接流出液后 再上样，重复三次 收集最

12、后一次穿透液， 取1 ml于1.5 ml离心 管中，标记“穿透” 收集最后一次穿透液， 取1 ml于1.5 ml离心 管中，标记“穿透” 6次wash buffer水洗Column buffer+10mM麦芽糖 的溶液洗涤（每加1 ml 用1.5 ml离心管收集) 共收集7管，做好标记 Elution buffer洗涤（ 每加1 ml用1.5 ml离 心管收集)共收集7管， 并做好标记 系统His-Tag系统pMAL系统 操作步骤 Elution buffer洗涤2次buffer+10mM麦芽糖 的溶液洗涤2次 加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存 后续反应 酶切去除标签 注：收集到的蛋白做好

13、标记后须在冰上保存，避免其失活 pMAL系统MBP标签的切除 从A595最大的几管(一般是第一、二管)取100 l用于蛋白 酶FactorXa的酶解，在100 l洗脱液中取15 ul保存在pcr管 中，作为酶切对照，剩下的加入2 ul的FactorXa后置于摇床 上震荡反应，室温下反应18 h，分别于第1h、3 h、6 h、17 h取样15 l。 三，SDSPAGE样品的制备 将收集到的14管目的蛋白和之前保存的 “上清 ”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20 ul于 对应的已经标记的1.5 ml离心管中，加入20 ul SDS-PAGE loading buffer ，将先前保 存的“诱

14、导前”“诱导后”（共4管）于 10000rpm/min离心1min，弃上清，沉淀用 15ul对应的buffer重悬，再加入15ul SDS- PAGE loading buffer，沸水浴15 min后， 放于第八组台面。 无细胞体系 生化分离工程实验（星期六） 四，Bradford protein assay 1、标准曲线的制作 （1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成 1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G- 250溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸 ，用蒸馏水稀释至1 L。 管号12345

15、67 标准蛋 白质（ ml） 00.010.020.040.060.080.10 蒸馏水 （ml） 0.10.090.080.060.040.020 考马斯 亮蓝G- 250试 剂（ml ） 5555555 A595 每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，25 min后以1号为对照调零测 A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲 注;震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除 管号1234567 HAZ和 Fabz(ml ） 0.050.050.050.050.050.050.05 蒸馏水（ ml） 0.050.050.050.050.050.050.05 考马

16、斯亮 蓝G-250 试剂（ ml） 5555555 HAZ A595 Fabz A595 五，未知蛋白浓度的测定 将保存的纯化的蛋白各取50 ul，加50 ul蒸馏水后再加入5 ml考马斯 亮蓝G-250染液试剂，漩涡震荡后静止25 min，以0.1 ml水加 5.0 ml的G-250试剂调零，测其在595nm处的吸光度。 生化分离工程实验（星期六） 六， 配制SDS-PAGE 试剂 分离胶（12%)浓缩胶(5%) ddH2O9.0 ml 5.0 ml 40%丙烯酰胺6 ml 1.0 ml 分离胶-buffer5.0 ml 不加 浓缩胶-buffer不加2 ml 10%APS100 l 60 l TEMED20 l 20 l 总体积20 ml 8 ml 每组配两块，均采用15孔梳子 注：在配胶前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）与胶板厚度的一致性 生化分离工程实验（星期天） v 跑SDS-PAGE v 点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟 使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20 ul。(记录点样 顺序) v 点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20