高效液相分析方法开发分享 梁杏梁杏 HPLC方法建立前的准备工作•分析样品的结构，熟悉样品的基本性质查阅文献有类似的方法可参考借鉴无类似的方法可借鉴紫外吸收分析结构正向或反相色谱进行分离流动相的选择等紫外检测器蒸发光散射检测器 目录•色谱柱的选择•检测波长的选择•流动相的选择•梯度的优化•其他 一.色谱柱的选择基本要求：有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度色谱柱的基本要素：填料，柱长，粒径，直径例如：5μm填料的色谱柱长要250mm；3.5μm填料的柱长要150mm等等柱长和粒径小了，流速增加很多，能节约分析时间，提高工作效率 填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测需要 •（1）API分析方法开发，需要做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要求来自不同厂家（Waters，Agilent，Phenomenex…)•（2）制剂分析方法选择色谱柱与API相似，但筛选实验较简单，一般根据样品性质直接选取一两只普通C18或者其他色谱柱进行比较。
•我们现有的色谱柱：（1）用于胶原蛋白大分子含量测定：Symmetry C18 5.0μm 4.6mm*250mm 100A （Waters）（2）用于氨基酸分析的：AccQ Tag For Hydrolysate Amino Acid Analysis 3.9mm*150mm （Waters）（3）用于外部校正：Supersil ODS2 5.0μm 4.6mm*250mm （依利特）（4）新柱子： Symmetry300 C18 5.0μm 4.6mm*250mm （Waters）专柱专用 二.检测波长的选择•紫外扫描：将样品配制成一定浓度，在紫外分光光度计上扫描，最大吸收处的波长作为检测波长•二极管阵列检测器（DAD、PDA）：做色谱峰纯度检查和选择检测波长 三.流动相的选择•流动相的有机相：一般选择甲醇和乙腈甲醇甲醇乙腈乙腈活性高，能与某些样品反应洗脱能力比甲醇强，很少与样品反应在低波长有紫外吸收，降低分析灵敏度，检测波长高于220nm截止波长比甲醇低20nm增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性系统压力高系统压力低毒性小毒性大 流动相的优化：•优化主要在水相上做改变，水里加酸、加盐，从而改善峰型，提高分离度。
•常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸等，通过加酸改变流动相的PH值，从而改善样品的分离度和峰形色谱柱主要都是硅胶基质，会造成样品峰拖尾，低PH帮助抑制硅胶基活性，减小拖尾水溶液中添加0.1%的磷酸或者TFA其PH值大概2左右所以液相分析方法时首选水加0.1%的磷酸或者TFA，然后再以此为基础做优化 •单独使用酸不行就要考虑使用缓冲盐，选择原则：简单、稳定、缓冲能力强，需要调PH值时要有相应的酸或碱•常用的缓冲盐：磷酸盐、钾盐、钠盐、醋酸盐，盐浓度在10-20mM左右•使用缓冲盐时要注意流动相混合后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题流动相的优化： 流动相调整小秘诀•秘诀一：由强到弱•秘诀二：三倍规则（每减少10%的有机溶剂，保留因子约增加3倍）•秘诀三：粗调转微调 四.梯度的优化•梯度的优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间，优化样品的分离度•有机相起始比例越小，样品保留时间越长，随着梯度的变化，样品出峰的先后顺序也有可能改变•在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在，为了提高样品的分离度，尽量使用大比例的水做梯度的起始•对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组成改变时不能有盐析出。
•例：氨基酸分析•流动相A：醋酸盐-磷酸盐缓冲液•流动相B：色谱乙腈 流动相C：纯化水 时间时间/min流速流速ml/minA液液%B液液%C液液%曲线曲线起始1.0981.20.8*0.51.0981.20.86151.0924.83.26191.0851056321.06521146351.00604011391.0981.20.811501.0981.20.86时间时间/min流速流速ml/minA液液%B液液%C液液%曲线曲线起始1.010000*0.51.0991011181.0924.806191.09190629.51.0831706331.00604011361.01000011451.0100006 分离度：0.823 分离度：1.50 五.其他•柱温•流速•溶样 。