单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,血清,γ,球蛋白的 分离纯化与鉴定,1,,【,实验目的,】,,1,．学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析分离纯 化蛋白质的基本原理及应用,,2,．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用,,3,．了解蛋白质分离纯化的总体思路,2,,,【,实验方法,】,,,,一、盐析法粗分,γ-,球蛋白,,二、凝胶过滤方法脱盐,,三、离子交换层析方法纯化,γ-,球蛋白,,四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定,γ-,球蛋白的纯度,,3,,【,基本原理,】,,,蛋白质的分离、纯化及鉴定,是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一不同蛋白质的,分子量、溶解度,及在一定条件下，,带电的情况,等都有所不同利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质4,,分离蛋白质的方法,分离方法,沉淀法,盐析法,,有机溶剂沉淀法,层析法,电学法,电泳法,,等电聚焦,,超速离心法,离子交换层析,,吸附层析,,凝胶过滤（分子筛）,,亲和层析,在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
5,,【,基本原理,】,,,本实验采用,硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析,方法，分离纯化血清,γ-,球蛋白最后用,醋酸纤维素薄膜电泳法,鉴定,γ-,球蛋白的纯度6,,实验思路,分段盐析去除杂蛋白,凝胶层析脱盐,交联葡聚糖吸水浓缩,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,先粗后细,离子交换层析纯化,7,,一、盐析法粗分离血清,γ-,球蛋白,,盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中,溶解度,不同，分别析出，达到彼此分离的方法本实验在,半饱和硫酸铵,溶液中，清蛋白溶解，,球蛋白将沉淀,析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液8,,定义,：,加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象原理,:,,破坏蛋白质两个稳定因素：,,,水化膜和电荷层,,中性盐：,(NH,4,),2,SO,4,、,Na,2,SO,4,、,NaCl,等优点：,蛋白质不变性，常用盐析法,9,,盐析步骤,取离心管一支加入血清,2ml,加入,2ml 0.9%,氯化钠摇匀,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和,(NH,4,),2,SO,4,4ml,上清液（主要含清蛋白）倾去,静置,10min,，再离心（,5000,转,/,分）,10min,沉淀用,1ml 0.9%,氯化钠搅拌溶解,逐滴加饱和,(NH,4,),2,SO,4,2ml,,,摇匀,静置,10min,，再离心（,5000,转,/,分）,10min,倾弃上清液（主要含,α,、,β,球蛋白）,沉淀即为初步纯化的,γ,－球蛋白,加入,0.0175mol/L,磷酸缓冲液（,pH=6.3)1ml,溶解,γ,－球蛋白,,粗提液,10,,二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐,,,欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法：,,,凝胶层析法、透析,,本试验采用,葡聚糖凝胶,——Sephadex G 25,层析,方法除去球蛋白粗提液中的盐,硫酸铵,，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。
11,,凝胶层析,原理：,P31,,凝胶层析法是按混合物各组分,分子量,大小,不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术凝胶,是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，,当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，,凝胶,层析以其为固定相层析时，,直径大于凝胶网孔的,大分子物质,不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而,小分子物质,直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间,层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的,12,,凝胶层析法脱盐,13,,凝胶柱层析脱盐,14,,分子筛层析,15,,数学模型,,Vo Vi Vt,Vi—,凝胶孔内水（内水）,,Vo,—,颗粒间水（外水）,,Vg,—,凝胶体积,,总体积,Vt,=,Vi,+,Vo,+,Vg,16,,Kd,—,分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数,,Ve,—,洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积,,K,d,=(V,e,-V,o,)/V,i,,,洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度,/,吸光度为纵坐标作图,17,,（,1,）完全被排阻的极端大分子，,Ve,=,Vo,，,Kd,=0,,（,2,）中等分子，,Ve,=,Vo,+,Kd,·,Vi,，,0<,Kd,<1,,（,3,）完全渗透的小分子，,Ve,=,Vo,+,Vi,，,Kd,=1,18,,▲,Sephadex G-25,的准备,,▲ 装柱（,15~20cm,）,操作步骤：,1,、,层析柱保持垂直。
2,、放蒸馏水，排出空气，关闭出口3,、加入搅拌均匀的,SephadexG-25,悬液，调节流速,10,滴,/min,，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至,18cm,4,、上留,1-2mm,的水，关闭出口注意：,★,床面上要保持少许,水，,防止胶床露出液面,★,胶面不平,，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，,,使表面平整19,,▲ 加样与洗脱,▲ 凝胶的再生,,1,、加样：,用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品,,溶液渗入凝胶2,、洗脱：,加入洗脱液，打开出口，保持流速,10,滴,/min,，收,,集洗脱液，每管收集,1ml,用,奈氏试剂,检测,NH,4,+,3,、保存：,20%,璜基水杨酸溶液,检测洗脱液的蛋白质,，保存,,含量高的进一步纯化,,,不断加洗脱液，使,NH,4,+,全部流出，为下次实验做准备,20,,脱盐,,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,②,上样,,γ,－球蛋白， 粗提液,①装柱,,葡聚糖凝胶,G-25,，,,柱高,18-20cm,流速：每分钟,10,滴左右,,③,加入洗脱剂,④收集,,20,滴换,,一支试管,21,,⑤,.,层析后洗脱液检测,白色比色板,,,洗净备用。
一块在各孔滴加奈氏试剂（检测,NH,4,+,）,,,另一块滴加,20%,璜基水杨酸（检测蛋白质）不用滴管,,,避免污染,,,直接倒,…,,用,“,-,”,表示无现象，用,“,+,”,,,“,++,”,,,“,+++,”,等表示颜色深浅,⑥ 回收凝胶,22,,注意事项：,,,1 .,凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 2.,加样分离时，滴速越慢，分离效果越好★,,以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果23,,三、,DEAE,－纤维素离子交换层析,,【,实验目的,】,,,1.,通过使用,DEAE,－纤维素离子交换层析法，,进一步,,纯化,γ-,球蛋白脱盐液，得到较纯的,γ-,球蛋白溶液,,,2.,学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用,24,,离子交换层析的基本原理,,离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定相如果其带负电，则能结合阳离子，成为,阳离子交换剂,；如果其带正电，则能结合阴离子，称为,阴离子交换剂,可根据实验需要，选择不同的离子交换剂进行离子交换层析。
DEAE,（二乙基氨基乙基）－纤维素,含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂25,,DEAE,－纤维素离子交换层析纯化,γ,－球蛋白,血清,α,、,β,、,γ,－球蛋白、清蛋白的等电点为：,,清蛋白,pI,=,4.64,，,,,α,2,球蛋白,,pI,=,5.06,，,,,β,球蛋白,pI,=,5.12,，,,,γ,球蛋白,pI,=,7.3,,本实验采用,0.0175 mol/l pH6.5 NH,4,Ac,缓冲液进行洗脱此,pH,，,DEAE,带正电荷，可与带负电荷的,α,、,β,-,球蛋白和清蛋白结合，而,带正电荷的,γ-,球蛋白不与,DEAE,结合，首先从层析柱中洗脱出来,，首先收集到的既是纯化的,γ,-,球蛋白26,,操 作,将脱盐后的球蛋白加于,DEAE,柱上（方法同凝胶过滤），用,0.0175 mol/l pH 6.3 NH,4,Ac,缓冲液洗脱，流速,10,滴～,15,滴,/,分，用小试管连续收集流出液（约,1.0 ml/,管），用,20%,磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况,，收集含量最高的部分，浓缩作纯度鉴定用该缓冲液洗脱下来的是,γ,－球蛋白27,,１,.,使用离心机的操作注意事项。
２,.,装柱时检查是否漏水３,.,装柱后凝胶,均一无断层，无气泡，柱床面平整,４,.,柱床面保持有缓冲液５,.,加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整６,.,每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染28,,四、,γ,－球蛋白纯化液的浓缩,,,利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量凝胶，离心，浓缩蛋白每,ml,纯化,γ,－球蛋白溶液加,Sephadex G-25 0.25 g,，摇动,2,～,3,分钟，离心,3000r/min,，,5,分钟，上清即为浓缩,γ-,球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）29,,五、,γ,－球蛋白鉴定,,,用,醋酸纤维素薄膜电泳,的方法，以血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳）30,,蛋白质的电离示意图,,31,,基本原理,1,、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法2,、在,pH8.6,巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动3,、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢,,32,,,血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳,33,,,,,,清蛋白,,1,2,,,,,加样线,加样线,纯化蛋白,对照,样品,34,,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,,点样 ：,,全血清：点样一次,,脱盐后的粗蛋白溶液：点样,3,～,5,次,,浓缩后的纯,γ,－球蛋白溶液：点样,3,～,5,次,35,,醋酸纤维素薄膜电泳,电泳条件,：,,电压：,90,－,110 V,；,,时间：,50,分钟。
染 色,：,电泳毕，关电源取出薄膜浸入盛有氨基黑,10B,染色液的染色缸中染色,5,分钟，用,2.5 %,醋酸洗脱液漂洗，直至背景呈白色以血清蛋白图谱为对照，观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何？,,36,,操作步骤：,1,、装置电泳箱区分电泳箱正负极 2,、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸,,干,—,,半干燥态铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样3,、放入电泳槽，使膜保持水平4,、通电：,110,伏，,1,小时断电后，取膜5,、染色：氨基黑,10B,染色,5min,6,、漂洗：漂洗液浸洗,3,次，每次,5-10min,快,37,,+,铅笔标记 ，垂直点样,保持膜不下垂,半干燥态,38,,,按泳动快慢顺序分为,：,清蛋白、,α,1,、,α,2,、,β,、,γ,—,球蛋白,39,,注意事项：,,1,、区分电泳槽正负极2,、点样处放在负极端，保持膜水平3,、点样面朝下，以防样品蒸发40,,。