发酵工程总结 王玉真第一章 绪论一．发酵工程：是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程 ※从广义上讲，有三部分组成：上游工程，发酵工程，下游工程二．发酵的定义1.传统发酵发酵（fermentation）最初是来自于拉丁语“发泡”（ferver）这个词，是指酵母作用于果汁或发芽的谷物时产生二氧化碳的现象2.生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式；或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO23..工业上的发酵：泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程三．※发酵工业产业化应抓好哪三个环节？ 发酵工程产业化:就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程 三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销①投产试验：涉及到”上、中、下三游”工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验②规模化生产：值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。
③市场营销：市场开拓对技术本身影响不大，但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素四． ※当前发酵工业面临三大问题：1.菌种问题(纯种;遗传稳定性;安全;周期短、转化率高产率高;抗污染能力强：噬菌体、蛭弧菌);2.合适的反应器(生产规模化;原料利用量大，并且具有一定选择性;节能;结构多样化、操作制动化;节省劳力);3.基质的选择(价廉;原料利用量大，并且具有一定选择性;易被利用;副产物少;满足工艺要求) 第二章 菌种的来源一． 自然界分离微生物的一般操作步骤？1、※菌种分离的一般过程：标本采集 → 预处理 → 富集培养 → 菌种分离（初筛、复筛）→ 性能鉴定 → 菌种保藏 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物2、微生物材料的标本采集：遵循原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种一般通过以下途径获得菌种：①向菌种保藏机构索取有关菌株；②由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等；③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标 土样采集应注意以下问题：A、不同的土壤特点 B、地理和气候条件C 、微生物的生理特性 D 、极端环境条件下采样分离 3、标本的预处理：（P16 表2-2）（1）物理方法：加热(55℃,6min；100℃,1h；40℃ 2-6h)、膜过滤法、离心法、空气搅拌法（2）化学方法：含1%几丁质培养基、用CaCO3提高pH值进行培养（链霉菌属）（3）诱饵法：用涂石蜡的棒置于碳源培养基中（诺卡氏菌）、花粉（游动放线菌）、蛇皮（小瓶菌属）、人头发（角质菌属）4、目的微生物富集的一些基本方法：富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株富集的基本方法：（1）、控制营养：如以唯一碳源或氮源作底物；表2-3 P17（2）、控制培养条件：如pH、温度、通气量等；（3）、抑制不需要的种类表2-4 P17富集培养方法：（1）、分批式富集培养P18：指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复几次后，再取此富集培养物接种至固体培养基上，以获得单菌落转种是关键2）、恒化式富集培养P18：通过改变限制性基质浓度，来控制两类不同菌株的比生长速率 5、菌种分离：（1）、常规分离法：平板划线法、稀释分离法和涂布法（2）、生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、抑菌圈法、生长圈法透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈 圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。
抑菌圈法：若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来生长圈法：常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集富集？富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株 ※什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施※ 什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？诱变育种：人工利用各种诱变剂诱发基因突变，再通过适当的筛选方法获得所需要的优良菌种的育种方法，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂物理的：紫外线、快中子、x射线等；化学的：硫酸二乙酯、亚硝基胍、Y啶类物质等；生物的：噬菌体、转座子诱变剂使用方法：1、紫外线诱变: 新鲜斜面菌种+生理盐水或缓冲液洗下→振荡→稀释菌悬液→取5ml菌悬液→无菌培养皿→磁力搅拌→15W、30cm紫外灯（营养体3~5min，芽孢10min）照射→黑纸包好增殖培养→挑单菌落2、化学诱变（以亚硝酸为例）亚硝酸易分解，故常在诱变前用亚硝酸钠在pH4.5的醋酸缓冲液中生成亚硝酸的方法现配现用。
处理真菌孢子：取孢子悬液2ml，加入1ml 0.1mol/L NaNO2溶液和1ml pH4.5醋酸缓冲液，27℃保温处理若干分钟（如10min）后，取出2ml加到10ml 0.07mol/L pH8.6的磷酸氢二钠缓冲液中，pH下降至6.8左右以后中止诱变然后稀释涂平板，培养后挑单菌落进行选择处理细菌 :将出发菌株接入5ml肉汤中，于370C振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，加入数亳升无菌生理盐水，洗涤一次，离心后菌体悬浮在2.5ml0.1mol/L醋酸缓冲液中（pH4.5），然后加入2.5ml0.1mol/L亚硝酸钠，在370C处理数分钟（如5min）后稀释涂皿，培养后挑取单菌落，选择突变株3、航天育种: 所谓航天育种是利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线的辐射作用下，使生物的遗传性状发生变异，从而选育出优良品种1996年以来，国防科工委相继组织了返地卫星和高空气球搭载微生物、动物细胞和植物种子，为微生物的诱变育种提供了新的手段六、※诱变育种对出发菌株有哪些要求？出发菌株：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株1.对菌株产量，形态、生理等情况了解；2.生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早；3. 对诱变剂敏感；4 菌株要有一定的生产能力；5.多出发菌株：一般采用3~4个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。
八、※工业上优良生产菌种应具备哪些基本特性？1.能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；2.遗传性能要相对稳定；3.菌种改造的可操作性要强；4.抗噬菌体及杂菌污染能力强；5.产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；6. 发酵条件如温度、pH、溶解氧等易控制九．初级代谢和次级代谢的异同：(P40)第三章 发酵培养基二、 常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些？……※速效碳源、氮源？？？1、碳源 （P82）作用： 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分 ；提供合成目的产物所必须的碳成分来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃2. 糖类：① 葡萄糖（速效碳源）② 糖蜜 ③ 淀粉 、糊精 三、 什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠四、 常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？（P83）1.无机氮源：铵盐、硝酸盐和氨水；特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。
但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化2. 工业上常用的有机氮源都是一些廉价原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟作用：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是某些产物的前体例 玉米浆（是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩物 ），是一种很容易被微生物利用的良好氮源： ①含丰富的氨基酸、生长因子（生物素、苯乙酸）；②较多的乳酸；③丰富的硫、磷、微量元素等五、 什么是前体？前体添加的方式？※前体：指某些化合物加入到发酵培养基中后，能直接使微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高添加方式：前体使用时普遍采用流加的方法……1. 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 2.流加也有利于提高前体的转化率3.前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化六、 什么是生长因子？生长因子的来源？※生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子 七、 ※举例说明培养基设计的方法与步骤？方法：①生态模拟②参阅文献③精心设计 ④试验比较步骤：① 根据前人的经验和培养基成分，初步确定可能的培养基成分；② 通过单因素实验最终确定出最为适宜的培养基成分；③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法例:类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化原培养基：类球红细菌Rhodobacter sphaeroides NH4Cl 1g，丁二酸钠1g， KH2PO4 0.2g ，MgSO4·7H2O 0.005g， Na2CO3 0.2g，酵母膏0.1g，复合无机盐溶液1 mL，水1000mL，pH7.0 优化后的培养基：NH4Cl 2g，乙酸钠2g， KH2PO4 0.1g ，MgSO4·7H2O 0.01g， Na2CO3 0.1g，酵母膏0.5g，复合无机盐溶液0.05 mL，水1000mL，pH7.0 。
第四章 种子的扩大培养二、※影响种子质量的因素是哪些？1.原材料质量： 生产过程中经常会出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质。