丙型肝炎病毒实验室诊断的现状和存在问题【摘要】 实验室诊断方法对丙型肝炎病毒（HCV）感染的确认和治疗的监测起着关键作用自从1989年HCV被鉴定至今近20年间，随着分子生物学检测技术的发展，HCV的实验室诊断也取得了长足进步，但同时也有很多问题需要研究和解决HCV抗体检测操作简便，耗时少，但对处于窗口期的标本容易漏检，且不能判别是活动性感染还是感染已被清除HCV RNA检测有较高的灵敏度和特异性，定量检测还可以用于抗病毒治疗监测；国际上，RNA检测的发展趋势为全自动化目前RNA检测亟待解决的两个问题是标准化和高成本问题近五年HCV抗原检测和抗原抗体联合检测试剂盒也已问世，但其灵敏度尚不及RNAHCV基因分型主要基于核酸杂交或直接测序原理，均有相应的商品化试剂盒，但其高成本限制了在临床实验室的广泛应用关键词】 丙型肝炎病毒；实验室诊断Progress and Challenges in the Laboratory Diagnosis of Hepatitis C Virus WEI Lai, Yang Ruifeng. Beijing University People’s Hospital, Beijing University Hepatology Institute【Abstract】Hepatitis C virus (HCV) is a common blood-borne pathogen that relies heavily on laboratory assays for the confirmation of infection. Anti-HCV testing is the earliest and classical method which is easy to perform but has a long window period (7~8 weeks with the third-generation method) compared to the nucleic acid test (NAT). NAT provides direct evidence for the presence of HCV and quantitative HCV RNA testing has been applied to monitor the antiviral response to treatment. In some developed countries NAT is also used for blood screening. Cost-effectiveness and standardization are the major challenges for NAT. In recent years HCV core antigen assay and the combination antigen-antibody assay have been introduced in some clinical laboratories and proved to be promising in the early diagnosis of HCV, whereas they still remain less sensitive than NAT and require methodological improvement. Finally, HCV genotyping assays based on sequencing or reverse hybridization can provide important prognostic information related to therapeutic response, however, it is rarely used in China due to the high cost.【Key words】 Hepatitis C virus; Diagnosis, Laboratory丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）以血液和性传播为主要传播手段，发病隐匿，症状不典型，加之公众对其认知水平较低，因此病毒的传播不易控制，患者也容易因不能及时诊断而错过治疗的最佳时机。
我国丙型肝炎感染高发时间在上世纪80年代末90年代初，90年代流行病学调查显示HCV抗体流行率约为3.2%，高于世界平均水平经过20年的发展，目前更多感染者出现了临床表现，在国家传染病报告中丙型肝炎的报告率逐渐增多，感染所带来的严重后果正日益显现控制丙型肝炎的传播、提高丙型肝炎的治疗效果需要依赖于及时、准确的实验室诊断1989年Choo[1]等首次应用分子生物学方法筛选得到一段来源于HCV的cDNA，并检测到了HCV抗体，次年第一代HCV抗体EIA试剂获得FDA批准并运用到血液制品筛查中，极大降低了HCV血源性传播的几率，在HCV的检测上具有里程碑式的意义；之后得益于分子诊断技术的进步，核酸检测（nucleic acid test, NAT），包括HCV RNA定性、定量检测应用于临床，大大缩短了HCV感染诊断的“窗口期”，也使抗病毒治疗的监测成为可能，特别是基于荧光共振能量转移原理的实时荧光PCR仪的应用，降低了扩增产物污染的可能性，简化了实验操作，使得PCR检测发生了革命性变化，分子诊断从此得到推广普及；近几年来，HCV抗原检测及抗原/抗体联合检测试剂也相继问世检测技术的进步和新技术的出现提高了HCV的实验室诊断水平，但各个方法也存在不少问题，需要我们今后研究和解决。
一、 HCV抗体检测： 经典，但有局限性HCV抗体检测诞生于上世纪90年代初，是最早用于HCV实验室诊断的方法，具有操作简便、耗时短等优点，被广泛运用于血液制品的筛查选和临床诊断目前大部分临床实验室使用第三代HCV抗体检测试剂，采用间接酶联免疫或微粒化学发光法，包被抗原除重组核心抗原外，还包括非结构蛋白NS3，NS4和NS5在HCV低流行率人群如无偿献血者中，HCV抗体假阳性问题一直比较突出根据美国CDC的研究结果，获FDA批准的Abbott HCV 2.0 及Ortho HCV 3.0 在抗体阳性率<10%的各类人群中，假阳性率平均为35%引起假阳性的原因很多，如重组蛋白纯度不足、血清成分如类风湿因子的干扰等等2003年美国CDC发布HCV抗体报告和实验室检测导则, 抗HCV抗体仅仅在重复检测S/CO≥3.8时才可能为真阳性，S/CO<3.8时应该进行重组免疫印迹（RIBA）的补充检测[2]；而S/CO值在0.5到1.0之间的高值阴性样品应注意是否为假阴性[3]我国HCV抗体检测试剂自1993年面世以来，经广大科技工作者和生产单位努力，经过国家“八五”到“十五”攻关，质量在不断进步，与当前国外主流的三代试剂相比，我国HCV抗体检测试剂在灵敏度和特异性上与国外基本没有差异，并且国产试剂在提高了对NS3抗原检测力度的同时，保持了对核心抗原检测的敏感性[4]。
但相比国外产品，国产试剂有两个特点：（1）阴阳性样品的OD值差别较小，不能将阴阳性分得很开，对处于临界值附近的样品易检测为假阳性或假阴性，这可能与抗原纯度不足或第二抗体浓度较高等因素有关；（2）不同国产试剂对真阳性的判定阈值S/CO各不相同，国外试剂一般为S/CO≥3.8判定为真阳性，而7种国产试剂S/CO从≥6.0到≥14.0不等[5]，这就要求我们不能套用美国CDC标准，要因地制宜制定自己的判定标准；也说明国产试剂盒之间的检测性能有较大的异质性需要继续加强对HCV NS3等蛋白的表达纯化和抗原性研究，努力提高试剂盒生产工艺，在提高特异抗体检出率的同时降低交叉反应RIBA是HCV抗体检测的确认试验，由于其成本效益比缺乏足够的优越性等原因，RIBA一直没有在我国上市实际上，在亚太地区，由于经济发展的不平衡，很多国家都难以采用RIBA对HCV抗体检测进行确认，甚至难以重复检测有鉴于此，2007年发布的《亚太地区丙型肝炎专家共识》指出，单次EIA检测S/CO达到预测真阳性的水平可报告为阳性，而单次EIA检测S/CO未达到预测真阳性的水平或接近S/CO值者应考虑HCV RNA定性检测和/或进一步获得样本进行HCV抗体和HCV RNA定性检测。
我国可以参考该共识进行临床HCV抗体的检测和报告同时，已有国产的HCV分片段抗体检测试剂问世，对于确认HCV抗体具有一定的价值特别是近来已有国产的免疫印迹试剂，对于今后改变单一依赖HCV抗体S/CO比值报告的局面有较大的帮助相比NAT，HCV抗体检测还有几点局限性：（1）抗体产生是病毒感染的间接证据，不能区分是现症感染还是病毒已被清除；（2）感染HCV的免疫力低下患者（如移植患者）及血液透析者血清中抗体水平很低甚至不产生抗体，容易漏检；（3）相比RNA和抗原检测，从HCV感染到抗体出现的“窗口期”较长，虽然第三代抗体检测的窗口期已缩短为7~8周，但仍不能完全满足临床早期诊断和献血员筛查的要求二、 HCV RNA定量检测：有待于进一步的标准化HCV RNA在感染1周内即可被检测到，比抗体出现早数周时间，直观地反映了病毒的存在，尤其在移植、HIV感染以及血液透析人群中，RNA检测常常作为HCV感染的主要确诊手段HCV RNA分定性检测和定量检测，定性检测的敏感度略高于定量检测；定量检测根据不同的原理，又分为实时荧光定量RT-PCR（如Roche Cobas Monitor HCV v2.0）、分支DNA（Bayer Versant HCV RNA v3.0）、转录介导扩增（TMA）及核酸序列依赖性扩增（NASBA）等，国内外临床实验室实时荧光定量PCR的使用占主导地位。
国际上，近5年来HCV RNA检测有向全自动化发展的趋势，突出表现在核酸提取的自动化——目前知名的核酸自动化提取平台有罗氏的MagNA Pure LightCycler和Cobas AmpliPrep，生物梅里埃的NucliSens easyMAG平台等MagNA采用玻璃磁珠吸附分离样本中的核酸，COBAS AmpliPrep采用生物素化的特异性寡核苷酸探针结合核酸，核酸-探针复合体与亲和素化的磁珠（Dynabeads）结合和分离，NucliSens则是利用硫氰酸胍溶解蛋白释放核酸，核酸被硅颗粒吸附而得以分离纯化相比手工提取，核酸提取的自动化降低了手工操作的时间，特别是降低了手工操作引起的误差及污染，提高了模板RNA的纯度，有助于控制检测结果的可重复性，适于大通量检测罗氏Cobas AmpliPrep/Cobas Taqman 48系统将自动核酸提取平台Cobas AmpliPrep和自动PCR检测平台Cobas Taqman 48对接，可实现核酸提取→PCR扩增/荧光信号检测→结果分析的整体自动化Sandres-Sauné[6]等报告，全自动化检测与传统的Roche HCV monitor v2.0相比，相关性良好（r=0.89，P<0.001），灵敏度达到15 IU/ml，线性范围更广（91 IU/ml ~5370000IU/ml），批内变异仅为0.3%~3.3%，批间变异为1.5%~6.7%。
可以预见，和酶免疫、化学发光免疫及电化学发光免疫检测的全面自动化一样，NAT自动化也是未来的发展趋势；临床检验的自动化将有力地推动临床检验的标准化不过Chevaliez[7]等的研究表明，Cobas AmpliPrep/Cobas Taqman 48对约15%的2型和30%的4型HCV RNA测定值偏低，可能系HCV 5’非编码序列中的突变引起引物和探针结合力降低所致；血清的1/5稀释也会造成RNA水平0.6 log10的降低，需要引起临床实验室的注意相比其他实验室检测如血清学检测，PCR依然是临床实验室。