第1课时目的基因的获得、基因表达载体的构建第4章第2节基因工程的操作程序目标导读1.阅读教材P7274图文，掌握猎取目的基因的两种方法2.结合教材P77图411，理解基因表达载体的构建过程重难点击1.目的基因的含义及常用猎取方法2.基因表达载体的构建3.大肠杆菌质粒DNA的提取课堂导入抑制疾病传播的转基因蚊子巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而削减了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！一、目的基因的获得二、基因表达载体的构建内容索引当堂检测一、目的基因的获得1.目的基因：目的基因：是指人们 的基因，如抗虫基因、抗病基因等2.猎取目的基因的方法猎取目的基因的方法(1)化学合成法概念：利用 直接合成基因适用条件：已知 的、相对分子质量 的目的基因。
仪器：缺点：成本昂贵，不适用于序列未知的目的基因所需要的进行讨论化学反应基础梳理核苷酸序列较小DNA自动合成仪(2)从基因组中直接分离法鸟枪法(如图所示)限制性内切酶同样的限制性内切酶连接酶质粒转化细菌克隆(3)PCR扩增：在掌握了目的基因的部分或全部信息后，可以设计 ，利用 直接扩增目的基因4)反转录法以 为模板，借助 酶，通过PCR仪合成与mRNA序列互补的 片段，然后在 酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的目的基因引物DNA扩增仪(PCR仪)mRNA反转录DNADNA聚合问题探究如图表示基因工程中猎取水稻某目的基因的不同方法据图分析：答答案案三种方法分别是：反转录法、直接分离法和化学合成法，都是在体外进行的1.图示分别是哪种方法？是在体内还是体外进行的？答案3.三种方法猎取的目的基因的碱基对的排列挨次都相同吗？答案答答案案不都相同方法b得到的是天然基因，方法a得到的目的基因和天然基因相比不含内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种2.三种方法都需要酶，分别是哪些酶？答答案案方法a需要反转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制性内切酶；方法c需要DNA聚合酶拓展应用1.下列获得目的基因的方法中需要模板链的是化学合成法鸟枪法反转录法PCR扩增目的基因A.B.C.D.解解析析化学合成法是利用DNA自动合成仪合成已知核苷酸序列的较小的基因。
鸟枪法是用很多个限制性内切酶去切割DNA获得目的基因，和化学合成法一样不需要模板反转录法利用mRNA作为模板反转录出一条单链DNA，然后以这条单链的DNA为模板合成出双链的DNA，也是目的基因PCR技术也需要模板答案解析2.下列属于PCR技术的条件的是单链的脱氧核糖核苷酸序列引物目的基因所在的DNA片段脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸DNA连接酶DNA聚合酶限制性内切酶A.B.C.D.答案解析知识拓展知识拓展PCR技术的基本原理和过程技术的基本原理和过程(1)原理：DNA双链复制2)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列3)过程第一步：加热至9498，DNA解链为单链；其次步：冷却至4060，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至72 左右，热稳定DNA聚合酶(TaqDNA酶)从引物起始进行互补链的合成如此重复循环多次4)结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)二、基因表达载体的构建1.实验：大肠杆菌质粒实验：大肠杆菌质粒DNA的提取的提取(1)实验原理基础梳理菌体释放上清液：_沉淀：_染色体DNA质粒DNA(2)方法步骤在超净工作台上(或在酒精灯旁)，取1 mL含质粒的大肠杆菌菌液，_于100 mL LB培育基中，于37 摇床振荡培育810 h，如无摇床可每0.5 h用手摇晃一次。
取1.4 mL菌液于1.5 mL EP管中，以10 000 rpm离心0.5 min，弃 加0.1 mL ，充分混合加入0.2 mL 轻轻翻转混匀，静置5 min(溶液要现配现用)再加入0.15 mL ，轻轻翻转混匀，静置5 min接种上清液预冷的溶液溶液预冷溶液以10 000 rpm离心20 min，取 于另一新EP管中加入等体积 的异丙醇或乙醇，混匀后静置于冰箱的冷冻室2030 min10 000 rpm离心15 min，弃上清液待沉淀稍干后，溶于50 L蒸馏水中取两支试管，分别加入1 mL蒸馏水，其中的一支加入提取的质粒DNA溶液，向两支试管中各加入1 mL ，混匀后，放入沸水中加热5 min待试管冷却后，观察两支试管中溶液颜色的变化发现，加入提取的质粒DNA的溶液变 ，另一个不变色上清液预冷二苯胺蓝2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的缘由单个基因或DNA片段导入另一生物体的细胞后，往往会被细胞内的 消灭掉，降低了目的基因的表达效率将目的基因和 一起进入受体细胞，可以保护目的基因不被受体细胞识别并破坏防御系统运载体(2)构建过程 酶切割质粒，使环状质粒消灭一个切口，露出_ 。
用同样的 酶切割目的基因，暴露出两个与质粒相同的 用 酶使质粒和目的基因结合成新的 分子表达载体用限制性内切DNA末端限制性内切DNA末端DNA连接环状质粒DNA2.同一种限制性内切酶切割后的质粒和目的基因片段混合后，是不是肯定是质粒和目的基因结合？问题探究结合右图重组质粒的构建过程分析：1.图中和分别用到哪种酶？答答案案用限制性内切酶，用DNA连接酶答答案案不肯定也可能发生质粒的自我环化或者目的基因的自我环化答案3.重组质粒上除了具有目的基因外，为了便利监测和筛选，还应具备哪种基因？答案答案遗传报告基因答案3.下列关于图中P、Q、R、S、G的描述，正确的是A.P代表的是质粒RNA，S代表的是外源DNAB.Q表示限制性内切酶的作用，R表示RNA聚合酶的作用C.G是RNA与DNA形成的重组质粒D.G是转基因形成的重组质粒DNA拓展应用答案解析4.如图为基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是A.氨苄青霉素抗性基因 B.启动子C.限制酶 D.DNA连接酶答案解析解析解析启动子是该表达载体所必需的，功能是启动插入基因的转录过程氨苄青霉素抗性基因可以作为报告基因，但不是必须用它作报告基因。
限制酶和DNA连接酶都不是表达载体所需要的基因表达载体的构成基因表达载体的构成知识拓展知识拓展目的基因的获得 法_PCR仪扩增_基因表达载体的构建启动子目的基因终止子报告基因目的基因从基因组中直接分离法课堂小结化学合成鸟枪法反转录法当堂检测1.在基因工程技术中，下列方法与目的基因获得无关的是A.辐射诱变法 B.从cDNA中猎取C.反转录法 D.人工合成法23451答案2.如图为用于基因工程的一个质粒示意图用EcoR限制性内切酶切割目的基因和该质粒，再用DNA连接酶连接形成重组质粒，然后导入大肠杆菌，最后将大肠杆菌放在四种培育基中培育：a无抗生素的培育基，b含四环素的培育基，c含氨苄青霉素的培育基，d含四环素和氨苄青霉素的培育基含重组质粒的大肠杆菌能生长的是答案23415A.a B.a和cC.a和b D.b和c234153.不属于目的基因与运载体结合过程的是A.用肯定的限制性内切酶切割质粒，露出黏性末端B.用同种限制性内切酶切割目的基因，露出黏性末端C.将切下的目的基因插入质粒的切口处D.将重组DNA引入到受体细胞中进行扩增答案4.下列哪项不是表达载体所必需的组成A.目的基因 B.启动子C.终止子 D.抗青霉素基因2341答案55.下面是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。
23415请据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在_的催化下，合成互补的单链DNA，然后在_作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是依据目标蛋白质的_序列，推测出相应的mRNA序列，然后依据碱基互补配对原则，推测其DNA的_序列，再通过化学方法合成所需基因反转录酶答案解析DNA聚合酶氨基酸脱氧核糖核苷酸(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、_、4种脱氧核糖核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成解析解析PCR过程中需要酶、底物、模板、引物等条件答案解析引物模板(A基因)23415(3)由A和运载体B拼接形成的C通常称为_解析解析目的基因和运载体结合，形成基因表达载体答案解析23415基因表达载体。