单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,实验二 总氮量的测定,―,凯氏定氮法,一 目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术,,二 原理：通过含氮有机物与浓硫酸共热生成硫酸铵，后与浓碱反应产生氨经硼酸吸收后用标准无机 酸滴定即可测出待测物中的总氮量,,三 试剂： 浓硫酸（化学纯）、粉末硫酸钾—硫酸铜混合物、,NaOH、,硼酸、盐酸、田氏指示剂（甲烯蓝乙醇与甲基红乙醇混合）、面粉,,四 器材： 凯氏定氮烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、50,ml,容量瓶、3,ml,微量滴定管、分析天平、烘箱、电炉、100,ml,蒸馏烧瓶、小玻璃珠,,五 操作步骤,,六 实验报告,1,,二、原理,,生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点甘氨酸的消化过程可表示如下：,,,CH,2,NH,2,COOH+3H,2,SO,4,2,CO,2,+3SO,2,十,4,H,2,O,十,NH,3,,2NH,3,+H,2,SO,4,(,NH,4,),2,SO,4,,,,,浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数,(,相当于待测物中氨的摩尔数,),计算出待测物中的总氮量。
本法适用于0.2 ~ 2.0,mg,的氮量测定2,,三、试剂,,1,、浓硫酸,,,200,mL,,2,、,粉末硫酸钾―硫酸铜混合物,16,g,,K2S04,与,CuS04.5H20,以 3,：,1,配比研磨混合,,3,、,30,％氢氧化钠溶液,1 000,mL,,4,、,2,％,硼酸溶液 5,000,mL,,5,、标准盐酸溶液,(,约,0,．,01,mol,／,L),,6,、,混合指示剂,(,田氏指示剂,),,,由,50,mL0,．,1,％,甲烯蓝乙醇溶液与,200,mL0,．,1,％,甲基红乙,l,醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色变色范围很窄且灵敏7,、市售标准面粉和富强粉各,2,g,,,3,,五、操作方法,1.样品处理,,,原因:,某一固体样品中的含氮量是用,100,g,该物质,(,干重,),中所含氮的,g,数来表示,(,％,),方法:一般样品烘干的温度都采用,105,℃，因为非游离的水都不能在,100,℃以下烘干在称量瓶中称一定量磨细的样品(如,0.1,g,左右的干燥面粉)，然后置于,105,℃的烘箱内干燥,4,小时。
用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品每干燥,1,小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重若样品为液体,(,如血清等,),，可取一定体积样品直接消化测定4,,2,消化,取,4,个,100,mL,凯氏烧瓶 标号各加,l,颗玻璃珠，在,1,及,2,号瓶中各加样品,0.1,g,，,催化剂,(,K,2,S0,4,―,CuS0,4,?5H,2,O)200 mg,，,消化液,5,mL,在,3,及,4,号瓶中各加,0,，,1,mL,蒸馏水和与,1,及,2,号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质每个瓶口放―漏斗，在通风橱内的电炉上消化注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出,SO,2,白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止定容：冷却后，加蒸馏水约,10,mL,注意慢加，随加随摇,),然后将瓶中溶物倾人,50,mL,的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用5,,改进型凯氏定氮仪结构,,6,,特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。
1),水蒸汽发生器和反应室,,(2),冷凝器和通气室,,(3),排水柱,,关键:搞清水管系统,7,,,蒸馏器的洗涤,１．,,接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水,(先关闭进水口,,,再关闭出水口,,,以排水口高度为宜,),,,用酒精灯将其加热烧开２．水的自动喷出：,,将蒸馏水由加样室加入反应室，,,将酒精灯移开片刻，,,,打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，,,如此反复清洗,3-5,次３．清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有,5,mL,，,2,％,硼酸溶液和,1,～,2,滴指示剂的混合液如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净8,,3蒸馏,过程：,准备:,,取,50,mL,锥形瓶数个，各加入,5,mL 2,％,硼,,酸溶液和,1,―,2,滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内加样:,,用移液管取,5,mL,消化液，细心地加入反应室，随后加入,30,％,NaOH,溶液,5,mL,，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封蒸馏:,,关闭自由夹,打开冷凝水,(,注意不要过快过猛，以免水溢出,),。
点燃酒精灯,,蒸馏开始,当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时,(,约,2,―,3,分钟,),，开始计时，蒸馏,3,分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约,1,cm,，,同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏,1,分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述 如此,3,～,5,次最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定9,,4.滴定,全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点10,,5.计算,,总氮量,=,C,(V,1,-V,2,),×,0.014/w,×,,消化液量,(,ml) /,滴定消耗用液量,(,ml),,c,为标准盐酸溶液摩尔浓度；,,V,1,为滴定样品用去的盐酸溶液平均,mL,数；,,V,2,为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均,mL,数,,w,为样品重量,(,g),14,为氮的相对量子质量若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，,,样品中蛋白质含量,(,％,),二总氮量×,6,．,25,,11,,思考题,,1,、何谓消化？如何判断消化终点？,,2,、在实验中加入粉末硫酸钾―硫酸铜混合物的作用是什么？,,3,、固体样品为什么要烘干？,,4,、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？,,5,、如何证明蒸馏器洗涤干净？,,6,、本实验应如何避免误差？,12,,。