胃癌标本的正确固定许 斌主要内容n 标本及时固定对生物标志物检测的 重要性n 胃癌手术标本固定的实践问题主要内容n 标本及时固定对生物标志物检测的 重要性n 胃癌手术标本固定的实践问题固定的意义固定是组织制片的基础及关键步骤，固定是否及时、彻底 ，影响着整个制片过程是标本处理过程的一个主要环节 固定目的1、保持组织形态学特征清晰和稳定 2、阻止组织、细胞自溶与腐败 3、凝固或沉淀组织细胞内物质 4、保存组织细胞抗原性 5、使组织保持一定的硬度和弹性Khoury T, et al. Mod Pathol 2009;22:1457-1467.延迟固定导致激素受体染色减弱固定延迟时间01234567平均Q值0min10min 30min1h2h4h8hER PRER、PR的平均Q值随固定延迟时间的增加而下降ER染色减弱的标本比例(n=58)(n=39)离体至固定时间P=0.03Li XX, et al. Mod Pathol 2013; 26, 71-78.延迟固定导致激素受体染色减弱延迟2h以上时间固定，出现染色减弱的比例升高+，无减弱；任一字母代表减弱，A：因细胞轮廓模糊，B：因非一致性信号；C：因核分辨不清病例编号0min 10min 30min1h2 h4 h8 h过夜总的荧光减弱例数1++++A,CCA,CA,C42++++A,B,CA,B,CA,B,CA,B,C43+++++CCC34+++CCCCC55+++CB,CB,CB,CB,C56+++++CCC37++++A,BA,BA,BA,B48+++A,BA,BA,BA,BA,B59++++++++010++++++A,BA,B2总的荧光减 弱例数+++3689935HER2荧光原位杂交检测结果与固定延迟时间的关系Khoury T, et al. Mod Pathol 2009;22:1457-1467.延迟固定导致HER2染色改变延迟1h之后，FISH染色开始减弱；2h之后，统计学上有显著性差异(P<0.05)编号0 min 10 min 30 min1 h2 h4 h8 h过夜1否否否否否否是是2否否否否否否否是3否否否否否否否是4否否否否否是是是5否否否否否是是是6否否否否是是是是7否否否否是是是是8否否否否否否是是9否否否否否是是是10否否否否否否否是总的受累例数00002578Khoury T, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012;20:531-542.总体组织形态学改变情况延迟固定导致组织形态学改变延迟固定2h标本开始出现明显的组织形态学改变，延迟固定8h和过夜的标本发生组织形态学改变的几率最高0 min 10 min 30 min1 h2 h4 h8 hONE-cadherin230230230230208204204204EGFR202020203311与延迟固定时间相关的膜标志物的表达(中位值)ON：过夜延迟固定导致EGFR和E-cadherin表达改变Khoury T, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012;20:531-542.EGFR和E-cadherin表达水平自延迟固定2h起开始下降延迟固定时间190195200205210215220225230235ON8h4h2h1H30min10min0score E-cadherin 染色评分随延迟固定时间的变化延迟固定导致Ki-67表达改变弥漫性染色病例所有病例延迟固定时间延迟固定对Ki-67的影响050100150200250ON8h4h2h1h30min10min0minKi-67表达水平在延迟固定4h和8h出现下降 Khoury T, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012;20:531-542.手术切除标本的有丝分裂象较活检标本平均高出3倍多(20±6 vs 6±2有丝分裂/ 10个高倍视野, P=0.008)；而两者间MIB-1免疫染色的肿瘤细胞比例则相当有丝分裂象计数采用MIB-1免疫组化检测评估乳腺癌的增殖指数活检标本手术切除标本有丝分裂 /10 HPF活检标本手术切除标本MIB-1(占肿瘤细胞的比例)Lehr HA, et al. Modern Pathology 2012:1-7.延迟固定导致肿瘤生物学特点改变手术切除标本有丝分裂象增加源自固定延迟：活检标本自离体至固定的时间为15~30 min，而手术切除标本则需数个小时主要内容n 标本及时固定对生物标志物检测的 重要性n 胃癌手术标本固定的实践问题手术标本及时固定的时间•SEOM/SEAP胃癌HER2检测共识1– 手术标本应在切除后30min内固定•中国胃癌HER2检测指南2– 规范的标本固定是HER2检测质量的保障，能使组织形态保存良好，防止细胞内蛋白和核酸的降解– 所有标本应在离体后20~30min内进行标记、切开、固定等初步处理•Werner M, et al3 – 标本应在手术切除后30min内尽快地固定，器官和实体瘤应予以切开以确保固定液快速渗透1. Gómez-Martín C, et al. Clin Transl Oncol 2011; 13:636-651. 2. 《胃癌HER2检测指南》编写组. Chin J Pathol 2011; 40:553-557. 3. Werner M, et al. Am J Surg Pathol 2000; 24(7): 1016-1019.SEOM/SEAP：西班牙内科肿瘤学会和西班牙病理学家学会据报道约20％的进展期胃癌有HER2过表达或扩增。
一 项国际多中心随机对照Ⅲ期临床研究(TOGA试验)的结果 显示，化疗联合针对HER2的曲妥珠单抗治疗可显著延长 进展期胃癌患者的生存期，基于这一结果，2010年欧洲 药品管理局及美国食品和药品管理局(FDA)先后批准化疗 联合使用曲妥珠单抗治疗HER2阳性胃及胃和食管交界处 癌(以下统称胃癌)患者《胃癌HER2检测指南》准确的胃癌HER2表达和基因扩增检测结果是 进展期胃癌HER2靶向治疗患者筛选和疗效预 测的前提《胃癌HER2检测指南》一、HER2检测方法 包括免疫组织化学染色(IHC)和原位杂交(inhibridization) 技术，后者包括荧光原位杂交(FlSH)和双色银染原位杂交 (DSISH)FSH和DSISH两种检测方法符合率高各有特 点，其中DSISH是一种亮视野下检测HER2基因扩增的方 法，易于观察，被认为更具有实际应用价值本指南推荐 IHC与FSH和DSISH相结合的检测策略《胃癌HER2检测指南》二、HER2检测适宜范围有可能进行曲妥珠单抗治疗的进展期胃癌 有必要行准确的HER2检测《胃癌HER2检测指南》三、检测流程和结果判断1．HER2状态检测首先选用IHC法。
2．IHc 3+的病例判断为HER2阳性，无需进一步做原位杂交检 测 3．IHC 1+和O的病例，判断为HER2阴性，无需进一步做原位 杂交检测 4．IHC 2+的病例为不确定病例，需进一步行原位杂检测，如 原位杂交阳性，判断为HER2阳性；如原位杂交阴性，判断为 HER2阴性《胃癌HER2检测指南》《胃癌HER2检测指南》对固定的要求免疫组化检测固定较差示例：胃癌•固定不完全会导致假阳性检查结果•细胞质染色可能由于使用了不适当的固定方式图片由Targos Molecular Pathology.提供30分钟内：p 应当完成什么？p 应当由谁完成？p 需要的哪些材料？30分钟内：p 应当完成什么？p 应当由谁完成？p 需要的哪些材料？组织处理不良示例未剪开固定固定液比例不足组织处理规范示例剪开手术标本供图：绍兴市人民医院病理科组织处理规范示例钉于标本板上供图：绍兴市人民医院病理科组织处理规范示例供图：绍兴市人民医院病理科组织处理规范示例浸泡于足量的固定液中供图：绍兴市人民医院病理科组织处理规范示例准确记录离体时间和固定(开始)时间供图：绍兴市人民医院病理科30分钟内：p 应当完成什么？p 应当由谁完成？p 需要的哪些材料？应当根据医院的实际情况， 由手术室和病理科协商决定ü如标本能于离体后30min内送至病理科 并完成处理，可以建议由病理科完成ü如标本不能于离体后30min内送至病理 科并完成处理，可以建议在手术室完成30分钟内：p 应当完成什么？p 应当由谁完成？p 需要的哪些材料？n 10%中性缓冲福尔马林溶液Ø 即 4%中性缓冲甲醛溶液Ø 中性（pH7.2 – 7.4）•避免酸性环境对组织和抗原造成的破坏•用自来水或纯水配置的甲醛溶液，常见pH5 – 7，可能使分子标志物检测的阳性率显著降低，导致误诊Ø 缓冲体系：•避免外界物质（如胃酸等）造成固定液pH值显著变化 ，进而对组织和抗原造成的破坏n 容器n 其他Ø 如标本板，大头针，手术剪等患者技术员肿瘤科医生/ 消化科医生病理科医生外科医生/ 内镜医生组织切除，固定及送检前保存标本处理及检测手段检测结果分析及报告申请标本检测及 安排标本收集HER2检测需多学科间共同合作总结•手术标本应及时剪开固定•应使用正确、足量的固定液•应准确记录立体时间和固定时间•外科和病理的合作至关重要37。