第一章 生物化学实验实验一、细菌碱性磷酸酶（BAP）在大肠杆菌中的诱导表达和Western检测Ⅰ 外源基因在大杆菌中的诱导表达一、实验目的和要求通过本实验了解外源基因在原核细胞中诱导表达的一般策略，并掌握IPTG诱导的一些要素二、实验原理将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E. coli 中表达先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D—半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达表达蛋白可经SDS-PAGE检测（本实验Ⅱ）或做Western-blotting，用抗体识别之（本实验Ⅲ）碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学中常用的工具酶之一它的作用是催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5-Pi末端转换成5-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究碱性磷酸酶有两种来源:一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,简称BAP)；另一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,简称CIP)关于碱性磷酸酶的活性测定原理，实验手册的其它章节将有介绍本实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组His-BAP的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，在IPTG的诱导下表达有活性的重组His-BAP并通过SDS-PAGE和Western-blotting进行鉴定三、仪器与试剂（一）材 料 BL21（DE3）大肠杆菌工程菌株（二）仪 器超净工作台，恒温水浴摇床，高速冷冻离心机，全自动高压灭菌锅，紫外分光光度计三）试 剂1、 LB（含50 ug/mL Amp）培养基2、 0.1mol/L IPTG3、 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)4、 1SDS上样缓冲液四、操作方法1．含有重组表达载体的BL21（DE3）大肠杆菌工程菌株在LB（含50 ug/mL Amp）培养基中预培养过夜（注意取菌株要在超净工作台中进行）2．20 mL LB 培养基加入10 uL 100 mg/mL Amp，使终浓度达50 ug/mL，并加入700uL过夜培养的上述LB培养液进行1:30扩大培养。
3．于37℃恒温摇床，180－200rpm，培养70－80min左右，使其OD600 达到0.5-0.74．加入210uL 0.1mol/L IPTG，终浓度达1.0 mmol/L，进行外源基因的诱导表达于28℃恒温摇床，180－200 rpm，继续培养4～5h5．诱导前和诱导后每隔1h取1mL菌液，12000rpm离心1min，收获菌体，弃上清6．500uL STE重悬菌体，12000rpm离心1min，收获菌体，弃上清，吸干残液7．100uL 1SDS上样缓冲液重悬菌体，100℃煮沸5min8．12000rpm离心1min，－20℃存放思考与讨论培养的菌液最佳状态为怎样？在试验中用什么进行衡量？Ⅱ SDS—PAGE 检测表达蛋白一、实验目的和要求1. 实习SDS—PAGE的基本操作，掌握垂直板电泳的操作技术；2. 学会用SDS—PAGE初步检测目的蛋白二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）和交联剂（cross-linker）又称为共聚体的N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠sodium dodecyl sulfate,简称SDS），则将分子所带电荷差异这一因素除去，分子在凝胶上泳动速度完全取决于相对分子质量蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，且具有相似的形状，在电场下，按相对分子质量大小在凝胶胶上排列蛋白条带经考马斯亮蓝R250染色后形成肉眼可见的蓝色条带，并可用凝胶成像系统分析条带蛋白含量和相对分子质量三、仪器与试剂（一）材 料细菌碱性磷酸酶（BAP），标准蛋白质（一）仪 器垂直板电泳槽，电泳仪电源，微量进样器，可调式微量移液器，大培养皿，烧杯（三）试 剂1、 5ⅹ电极缓冲液：Tris3.78g、甘氨酸23.5g、加水到250ml溶解，使用时稀释5倍2、 30%丙烯酰胺混合液：29g丙烯酰胺和1g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于水，定溶至100ml用0.45μm滤膜过滤，存于棕色瓶中，于4℃保存，pH值不大于7.03、 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris(pH 8.8):9.08gTris溶于40ml水中，以4 mol/L调至pH 8.8，加水至50mL，于4℃保存4、 浓缩胶缓冲液1.0mol/L Tris(pH 6.8)：6.08gTris溶于40ml水中，以4 mol/L调至pH 6.8，加水至50mL，于4℃保存。
5、 10%SDS:10g电泳级SDS加水900mL，加热到68℃助溶，浓盐酸调至pH7.2定容1L，分装备用6、 10%过硫酸铵：4℃保存，一周内用完7、 2ⅹ样品缓冲液：含有0.1 mol/L Tris(pH 6.8)，0.2 mol/L二硫苏糖醇（DTT），4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油8、 甲醇、乙酸溶液：将900mL甲醇：水（500 mL和400mL水）与100mL乙酸混合9、 染色液:在每100mL甲醇、乙酸溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250，用Whatman1号滤纸过滤除去颗粒物10、脱色液： 乙醇：乙酸：水=25：10：6511、TEMED四、操作方法1． 配制分离胶①准备好玻璃板，置于电泳模盘之上②配制分离胶： 凝胶浓度/%8101215双蒸水/mL9.37.96.64.6Acr/Bis（30%）mL5.36.78.010.01.5mol/L TrisHCl（pH 8.8）/mL5.05.05.05.010%（W/V）SDS/uL20020020020010%Aps/uL200200200200TEMED/uL12.08.08.08.0总体积/mL20.020.020.020.0混匀后加入两玻璃板中间，并小心在胶面上加入1mL正丁醇（或去离子水），静置约30 min，等胶自然凝聚后倾斜倒出正丁醇，吸干残液，并在两玻璃板夹缝中水平插入1.5 mm的梳子（在胶面上加入去离子水或正丁醇称封胶，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶）。
2． 5%浓缩胶的配制双蒸水3.40 mLAcr/Bis（30%）0.83 mL1.0mol/L TrisHCl pH 6.80.63 mL10%（W/V）SDS50.0 uL10%Aps50.0 uLTEMED5.00uL总体积5.00 mL混匀后加入到夹缝中，并没过梳子，待凝固后（约30 min）小心拨出梳子，除去封胶条将电泳模盘放入电泳槽中，用拉直的曲别针拨正凝胶孔，在阴极和阳极注入适量1电泳缓冲液3．电泳 第一孔加10 uL 标准蛋白（若做印迹，需加预染蛋白Marker），其余孔加样品10 uL接通电源，60V恒压电泳，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在90V当溴酚蓝泳动出凝胶时切断电源，停止电泳4．将胶板从电泳槽中取出 小心从玻璃板上取下胶弃去浓缩胶，将分离胶用考马斯亮蓝染色液染色（也可将此分离胶作印迹用），染色15min，脱色约30min，蒸馏水中漂洗至背景清亮5．在凝胶成像系统中分析特异条带的位置和分子量思考与讨论你认为本实验成败关键因素在哪里？为什么？III 蛋白质印迹一、实验目的和要求通过本实验了解蛋白印迹的原理、基本流程和操作要点二、实验原理印迹法一般由凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。
1．生物大分子凝胶电泳分离 蛋白质印迹法的第一步一般是将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳，使待测蛋白质在电泳中按相对分子质量大小在板状胶上排列2．分子区带的转移和固定 第二步就是把凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理并容易检出的，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子现用得较多的载体材料为硝酸纤维素膜（NC膜）和偏二氯聚乙烯膜（PVDF膜），它们和生物大分子都是非共价结合3．特异性谱带的检出 印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体、抗原的亲合反应在目的蛋白先与其特异性抗体（一抗）反应，然后再加入偶联了可检测的酶或特殊蛋白的二抗，孵育后用底物直接显色或测荧光、放射性，从而检测出我们感兴趣的抗原（目的蛋白）来，考虑到如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料，如丽春红，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功三、仪器与试剂（一）材 料 实验II的电泳凝胶，一抗，酶标二抗（二）仪 器凝胶成像系统，转移电泳仪，电泳转移槽及转移夹，水平摇床，海绵垫、滤纸等，乳胶手套，镊子，玻璃培养皿，二氯聚偏二乙烯膜（PVDF膜）（三）试 剂1、 TBS Tris-HCl NaCl缓冲液：20mmoLHCl,500mmoLNaCl,pH7.5。
2、TBS Tris-HCl NaCl,Tween20缓冲液: 20mmoLHCl,500mmoLNaCl,0.05% Tween20,pH7.53、 转移缓冲液：25mmoL/L Tris，192mmoL/L甘氨酸，20%甲醇，pH8.34、 去离子双蒸水5、 100%甲醇6、 封闭液 ：5mL TBST+0.25g脱脂奶粉7、 二氨基联苯胺（DAB）8、 过氧化氢（H2O2）四、操作方法1．取出凝胶，切去浓缩胶，分离胶也可以做适当裁减（电泳时最好使用预染Marker这样在以后可以检查转移效率）用灭菌去离子水冲洗，然后放入转移缓冲液中浸泡平衡2．戴乳胶手套将PVDF膜裁成和需印迹凝胶相似而略大的小块，用100％甲醇处理15S（不可超过），然后放入转移缓冲液中平衡15min3．海绵垫2块放入转移缓冲液中浸泡到没有气泡；将滤纸裁成比凝胶和硝酸纤维素纸略大的片，共4片，转移缓冲液中浸湿，然后按以下顺序组装转移装置：阴极黑板－海绵垫－2层滤纸－凝胶－PVDF膜－2层滤纸－海绵垫－阳极红板4．恒流80mA转移2.5-3h，可于冰水浴中操作5. 卸去装置，取出PVDF膜置于。