实验十七 细胞同步化一、实验目的：理解细胞同步化的基本原理掌握同步化实验技术加深对细胞周期各时期的理解，进一步掌握细胞培养技术二、实验原理：细胞同步化是指自然的或经人为选择或诱导造成的细胞周期同步化，前者称自然同步化，后者称人工同步化而人工同步化又可分为：选择同步化和诱导同步化诱导同步化：是指利用药物阻断代谢，把细胞阻断于细胞周期的某一点上，然后将细胞转入正常培养液中使细胞同步化的方法例如用羟基脲和过量胸腺嘧啶核苷均可将细胞阻断在G1/S交界处，从而获得S期细胞的同步化；利用秋水仙素将细胞阻断在分裂中期；培养基中缺乏异亮氨酸则可将细胞阻断于G1期下面介绍阻断细胞于S期的TdR阻断法①TdR阻断法：在培养的细胞中加入过量的TdR，则能抑制细胞DNA合成其机制为2mM TdR引起DNA合成减慢的原因因为它反馈抑制二磷酸核苷还原酶活性（见图）这个抑制DNA合成可以被加入脱氧胞嘧啶核苷（dCdR）而解除因为dCdR排除了胞嘧啶核苷二磷酸盐转化为脱氧胞嘧啶核苷二磷酸盐的必要性二次给予过量的TdR法：第一次阻断时间相当于G2，M和G1期时间的总和这就使得为些部分的细胞都积累在G1/S区域然后通过细胞洗涤而释放，使所有被累积在G1/S期细胞以及原先停留在S期的细胞都能通过S期。
然后第二次给予过量的TdR，则使细胞大部分被积累在G1/S处，后按上述方法使抑制释放就能得到较高同步化的S期细胞②选择同步化；主要是有丝分裂选择法单层培养细胞处于对数生长期时，细胞分裂活跃，分裂细胞变园，隆起，与培养器的附着性降低，稍加振荡，M期细胞则脱落而悬浮于培养液中，倾出培养液贮于4℃冰箱中保存，再加入新鲜培养液37℃继续培养，30分钟后，再依上法收集M期细胞，反复上述操作，便可获得一定数量的中期细胞，以供研究此法的优点是细胞不受药物等的伤害三、试剂和器材 试剂：RPMI-1640培养基，Eagle培养基，小牛血清，PHA，TdR（H3TdR）,CdR，双抗 器材：37℃培养箱，培养瓶，吸管，移液管，恒温水浴锅，倒置显微镜，离心管 实验材料：人外周血细胞，HeLa细胞，CHO细胞或其它细胞四、操作步骤（一）阻断细胞于G1/S期交界处的TdR双阻断法：在含有10%小牛血清，03ml PHA（浓度同前面的实验）的5ml RPMI-1640培养液中接种04ml人外周血置37℃恒温培养箱内培养72小时72小时后，向培养瓶内加入TdR至终浓度2mM，继续培养17-19小时移培养物于有盖离心管底，1000rpm离心8分钟，收集细胞沉淀，用新鲜的不含TdR的培养液（37℃）悬浮细胞，1000rpm离心，收集细胞，如此洗涤细胞3-4次，去除TdR。
加入新鲜温浴好的培养液，继续培养9小时后，加入TdR再次阻断16小时用新鲜培养液（不含TdR）清洗三次，进行释放，这时的细胞大部分处于G1/S交界处，随释放时间的推移，同步化细胞逐渐进入S期二）机械振荡法收集M期同步化细胞：选用CHO细胞培养于含10%小牛血清Eagle培养中，使用若干大型100ml的方型培养瓶，每瓶接种细胞数为2×106个37℃恒温培养约30小时，细胞进入对数增殖期，这是细胞呈单层帖壁生长将水平方向轻轻摇动培养瓶，弃去旧培养液，换入新鲜温浴的培养液，37℃继续培养，此目的在于除去漂浮和游离的间期细胞，死亡细胞或细胞碎片培养15分钟以后，取出，水平方向轻轻摇动10-15次，将带有振荡下来的细胞的胰液收入无菌离心管，4℃保存再向培养瓶中加入新鲜温浴培养液为获得较多的M期细胞，可以每隔15分钟，按步骤4收集一次细胞悬液，贮存将所有细胞悬液置于一大的离心管中，以1000rpm离心10分钟，吸出上清，改换新鲜温浴的培养液，轻轻打匀，放入37℃温箱内培养此时大约有90%的细胞进行M期同步分裂五、实验报告。