“绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白” ”让未知世界显影让未知世界显影 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien （钱永健） 2008年10月8日，美Woods Hole海洋生 物学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁- 沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三 位美国科学家，因为在水母中发现和研究绿 色荧光蛋白而获得2008年诺贝尔化学奖 GFP发现之旅； 1962年，下村修首次从维多利亚多管水母 Aequorea victoria 中分离出GFP他发现该蛋白在 紫外线下会发出明亮的绿光 1992年，道格拉斯·普瑞舍克隆并测定了水母 中绿色荧光蛋白的基因 1993年， Martin Chalfie证明了GFP作为多种 生物学现象的发光遗传标记的价值在最初的一项 实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞 有了颜色 1994年，钱永健开始改造荧光蛋白，培育出 黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白， 理解了GFP发出荧光的机制世界上目前使用的荧 光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种令在同 一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实钱永 健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。
维多利亚多管水母（Aequorea victoria） GFPGFP简介简介 v 维多利亚多管水母生活在北太平洋寒 冷水域这种水母体内含有一种生物发光 蛋白质——aequorin，它本身发蓝光 GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水 母容光焕发的时候我们实际看到的颜色 GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但 是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜 绿的颜色这种蛋白质从阳光中吸收紫外 光，然后以能量较低的绿光形式发射出来 GFPGFP结构结构 v蛋白序列 SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSV SGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP WPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFK SAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEV KFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKL EYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRH NIEDGSVQLADHYNTPIGDGPVLLPD NHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFV TAAGI vGFP由238个氨基酸残基组成，分子量约 为26.9kDa。
GFPGFP结构结构 GFP结构 vGFP结构 GFPGFP结构结构 GFPGFP结构结构 GFP晶体结构显 示 , 蛋白质中央 是一个圆柱形水 桶样结构 , 长 420 nm , 宽 240 nm , 由 11个β片 层组成桶状构成 疏水中心和由4 个α螺旋以及其 中一个α螺旋包 含着的发光基团 构成 GFPGFP结构结构 GFPGFP结构结构 v桶的顶部由 3 个短的垂 直片段覆盖 , 底部由一个 短的垂直片段覆盖 , 对荧 光活性很重要的生色团则 位于大空腔内严密的桶 形结构保护着荧光基团， 防止它被周围环境淬灭 实验表明 GFP 荧光产生 的前提是桶状结构完整性 , 去除 N 端 6 个氨基酸或 C 端 9 个氨基酸 ,GFP 均 会失去荧光这是由于生 色团形成的效率较低 , 而 且形成过程受外界环境影 响较大的缘故 GFPGFP结构结构 GFPGFP结构结构 GFPGFP独特的结构独特的结构 v由238个氨基酸组成 v“像一个罐头” v每个单体由11个反向平行的-sheets围绕 ，4个-helix组成，其中一个-helix位于 “罐头”内 v大约长 420 nm , 宽 240 nm v荧光基团位于核心的-helix GFPGFP结构结构 由α螺旋含有发光基团由 第 65 、 66 、 67 位丝氨 酸、酪氨酸、甘氨酸形成 生色团构成。
翻译出的蛋 白质折叠环化之后 , 在 O 2 存在下 , 分子内第 67 位甘氨酸的酰胺对第 65 位丝氨酸的羧基的亲核攻 击形成第 5 位碳原子咪唑 基 , 第 66 位酪氨酸的 α2β键脱氢反应之后 , 导 致芳香团与咪唑基结合 这样 , GFP 分子中形成 对羟基苯甲酸咪唑环酮生 色团 , 该过程可以自动催 化完成 v1. 两个野生型 GFP吸 收紫外光和蓝光，发射 绿光，在 395 nm 出现 一个最大吸收峰 , 在 470 nm 出现一个小的 吸收 出现两个吸收峰 的原因可能是由于存在 阴性和中性两个不同化 学结构的生色团由于 存在两个吸收峰, 野生 型 GFP 可以被标准的 长波紫外 源和异硫氰酸 荧光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC) 所激发 GFPGFP性质性质 v2. 能够在单独或者与其它蛋白融合时产生 荧光而其最显著的特点是除了氧气之外 ，不需要其他辅酶，不需底物 v3. BairdBaird等研究人员发现，虽然等研究人员发现，虽然GFPGFP有紧密有紧密 的桶状结构和形成发光基团所必需的复杂的桶状结构和形成发光基团所必需的复杂 的翻译后修饰，当对的翻译后修饰，当对GFPGFP的的N N端和端和C C端部分端部分 交换重排并以一段间隔重新连接时，交换重排并以一段间隔重新连接时，GFPGFP 仍然具有荧光。
并且，仍然具有荧光并且，GFPGFP的某些位点可的某些位点可 以耐受整段蛋白的插入，在结合金属离子以耐受整段蛋白的插入，在结合金属离子 的黄色荧光蛋白（的黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Yellow Fluorescent Protein, YFPProtein, YFP，，GFPGFP的突变体）中的突变体）中145145位插位插 入锌指结构能使荧光强度多倍提高入锌指结构能使荧光强度多倍提高 v4. GFP作为报告分子具有很多优点，如实 现了活细胞内基因表达和定位、荧光为蛋 白的内在属性、荧光发射无种属依赖性、 荧光信号对光漂白具有高抗性、检测时不 需要附加辅助因子、在细菌和真核细胞中 表达无明显毒性、具有高度稳定性另外 ，细胞内GFP的检测也比较简单，如利用 紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选 仪等，现有报道利用实时定量PCR进行 GFP荧光定量测定的方法 GFP GFP应用应用 1. 1. 在蛋白质相互作用和构型变化研究中的应用在蛋白质相互作用和构型变化研究中的应用 一种活细胞内蛋白质相互作用的研究方法是一种活细胞内蛋白质相互作用的研究方法是 蛋白质片断互补测定法（蛋白质片断互补测定法（protein-fragment protein-fragment complementation assay, PCAcomplementation assay, PCA）。
将标记蛋白在）将标记蛋白在 某个位点打开，用片断分别标记两个蛋白如果某个位点打开，用片断分别标记两个蛋白如果 被标记蛋白质相互作用，则酶或荧光蛋白片断靠被标记蛋白质相互作用，则酶或荧光蛋白片断靠 近并重新折叠恢复活性近并重新折叠恢复活性 HuHu等提出了双分子荧光互补实验（等提出了双分子荧光互补实验（BiFCBiFC）的）的 概念，用互补的荧光片断标记不同蛋白来研究概念，用互补的荧光片断标记不同蛋白来研究 bZIPbZIP和和RelRel转录因子家族的相互作用，确定了相转录因子家族的相互作用，确定了相 互作用位置，信号传递对作用位点的调节等互作用位置，信号传递对作用位点的调节等 vv 荧光互补不仅仅在蛋白质相互作用中有所应荧光互补不仅仅在蛋白质相互作用中有所应 用，用，JeongJeong等研究人员以与底物结合时会有典型等研究人员以与底物结合时会有典型 的构象变化麦芽糖结合蛋白（的构象变化麦芽糖结合蛋白（MBPMBP）为模型，将）为模型，将 MBP CMBP C端和端和N N端分别与端分别与GFPGFP片断融合结果证明片断融合结果证明 加入底物的一组显示出比对照组更强的荧光，由加入底物的一组显示出比对照组更强的荧光，由 此提出此提出split-GFPsplit-GFP在观察蛋白构型变化中的应用。
在观察蛋白构型变化中的应用 vv 另外，一种重要的荧光成像技术另外，一种重要的荧光成像技术——荧光共振荧光共振 能量转移（能量转移（fluorescence resonance energy fluorescence resonance energy transfer, FRETtransfer, FRET）也被广泛应用它能够利用）也被广泛应用它能够利用 GFPGFP及其突变体青色荧光蛋白（及其突变体青色荧光蛋白（CFPCFP）、黄色荧）、黄色荧 光光蛋白蛋白（（YFPYFP）等，定时、定量、定位、无损伤）等，定时、定量、定位、无损伤 地在活细胞内检测大分子构象变化、蛋白之间相地在活细胞内检测大分子构象变化、蛋白之间相 互作用、信号传递途径互作用、信号传递途径 v2. GFP 在信号转导中的应用 v 研究发现 , 某些突变的 GFP 能够发生荧光共 振能量转移 （ FRET ），FRET 对于两个荧光 分子相互间的定位和距离高度敏感 ( 在纳米范围 内 ) 两个分子间微小的线性或空间定位关系的 破坏可以强烈地改变能量转移的效率通过计算 供应分子对于接受分子荧光释放的比率来观测细 胞动态变化的指标。
它消除了 GFP 分子在绝对 浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的 绝对效率等的影响利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物探针 , 现已有研究人员设计大分子或 分子配对物来改变 GFP 之间原有生理信号反应 的 FRET 在上述实验基础上 , 研究人员设计了 FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂 , 该实验 发现 , 通过改变两个 GFP 之间的距离 , 可 增加 FRET另有一些研究人员 , 并没有 把两个 GFP 融合在一个单一结构中 , 而是 把一个 GFP 融合到 CaM 上 , 另一个 GFP 融合到 CaM 结合区域结果发现 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 出现分子间异源二聚 体 , 两个 GFP 足够接近而产生 FRET 这个实验提示了 FRET 不仅可以在分子内 发生 , 而且还可在分子间发生 v 最近 , 有学者用 GFP 依赖的生物传感 器测量活细胞内生化动力学 , 通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞 , 观测有 关 cAMP 的动态荧光变化 通过融合蓝色 荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位 , 设计出了 cAMP 传感器。
当 cAMP 浓度很低时 , 两 个荧光分子距离很近 , 并出现 FRET , 如果 增加 cAMP 浓度 , 发生 FRET 的可能性急 剧下降利用该方法 , 可以检测出 cAMP 的动态变化 , 并开创了在整体条件下 , 研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法 v GFP 的结构虽然具有高度完整性 , 但 是实验中发现 , 在 GFP 中某些确定的位 置 , 插入外源基因 , 完全没有丧失其荧光 性当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体 中 , 得到 Ca 2+ 传感器 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 导致生色团去质子化 , 使荧光强 度增加 7 倍当在黄色荧光 GFP 中插入 一个 Zif268 锌指结构 , 可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP , 结果发现荧光少量增加 , 为改 变前的 1.7 倍 , K d 值约 0. 4mmol插入 外源基因致使 GFP 荧光敏感性增强的现 象 , 提供了一个获取永久编码传感器去监 测细胞信号转导的新路径 改进改进 GFP GFP 的应用前景的应用前景 蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白， 褐色。
v1. 提高了GFP的光谱性质。