试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100 mg 溶于 50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL 二、标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用9gl/L NaCl 配制成 0.1 mg/mL 蛋白溶液 三、器材 试管 1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴 ;分光光 度计 操作方法 一、制作标准曲线 取 7 支试管，按下表平行操作 试管编号0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白溶 液（ mL） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 9gl/LNaCl （mL） 0.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 考马斯亮蓝 试剂 4mL 蛋白质浓度 ug/ml 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 摇匀， 1h 内以 0 号管为空白对照，在595 nm 处比色 绘制标准曲线：以A595 nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取1 样品，加 4ml 考马斯亮蓝溶液，使其测定值在标准曲线的直线范围内 根据所测定的A595 nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样 品的蛋白质浓度(ug/mL) 超出范围应稀释样品 注意事项 在试剂加入后的5-20 min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色 杯洗干净 利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色 杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定， 防止误差 Oorigin 做直线图，直线拟合后出如下图，R 2=- 0.997 Y=0.00687 X + 0.0527 ，应用公式计算未知样品蛋白质浓度。