生物化学大实验醇脱氢酶 (alcohol dehydrogenase， ADH) 是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用生物体内的很多醇类代谢物都是通过醇脱氢酶催化完成的醇脱氢酶来源广泛，种类繁多，可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶，所含肽链氨基酸残基数分别为250、 375和 600-750， 酵母醇脱氢酶(yeast alcohol dehydrogenase，YADH) 是其中和应用最为广泛的一种酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH为辅酶， 可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应酵母醇脱氢酶为四聚体，单个亚基肽链含有347 个氨基酸残基，亚基相对分子质量为35000实验一酵母醇脱氢酶的提纯一、目的学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法二、原理以酵母为原料，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法，提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶在提纯过程中每经一步提纯处理，都需要测定酶蛋白质含量和活力，并计算得比活力(比活力 =活力单位数 \mg 蛋白质 )惟有比活力提高了，才证明所用提纯措施有效，酶制剂的纯度提高了三、实验器材1.干酵母粉：将鲜酵母分散成小块，放在搪瓷盘吹干。
干燥后，研磨成粉末(80 目)2.烧杯 250m1(×1)， 150m1（× 2) 3.吸管 0. 1m1(×3)， 0.5ml(×3)，1ml(×3)，2ml(× 2)，5ml(×2) 4.量筒 2 000mI(×1)，250m1(×1)5.容量瓶 100m1(×1)，250m1(×1)， 100ml(×1) 6.试管 1. 5cm×15cm(×5) 7.研钵×8水浴锅9.电子天平 . 10.离心机 (5000r\min) 11.722(或 7220 型)分光光度计四、实验试剂1、3mol \L 乙醇溶液：量取无水乙醇(比重 0. 789，相对分子质量46. 07)174.6m1，加蒸馏水稀释 1000ml . 2、.丙酮 ( A.R.)3、0. 066mo1\L 磷酸氢二钠溶液：溶9.37g 磷酸氢二钠于蒸馏水并稀释至1000ml. 五、操作(1)粗提将 20g 干酵母粉于250m1 烧杯中，加入0. 066mo1\L 磷酸氢二钠溶液80ml，37℃水浴锅保温 2h，不断搅拌，再于室温提取3h，离心 20min(4000r\min) ，取上清液2ml.测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量得体积后，倾于150ml 烧杯中 . (2)热变性沉淀杂蛋白将上清液55℃保温15-20min ，不断慢速搅拌，保温毕，立即置冷水中冷却，离心20min(4000r\min) ，吸取上清2ml 测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量得体积后，倾于烧杯中。
3)有机溶剂沉淀杂蛋白将上清液置盐冰浴中降温至－2℃度以下，按100ml 上清液加50ml 丙酮的比例加入预先预冷至－ 2℃以下的丙酮，边加边搅拌， 加毕，放置片刻，低温离心15min(0℃， 4000r\min) ，吸取上清液2ml 测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量得体积后，倾入已置于盐冰浴的烧杯中4) 有机溶剂沉淀酶蛋白按 100ml 上清液加55ml 丙酮的比例，逐滴加放冰冷之丙酮，使溶液保持－2℃以下待沉淀完全后，低温离心15min(0℃，4000r\min) 弃去上清液，沉淀溶于少量蒸馏水，转移至透析袋内，对冷水透析3h(在冰箱中进行)，离心除去沉淀，上清液即为达到一定纯度的醇脱氢酶制剂将各步得取得的样品进行蛋白质含量测定及酶活力测定实验二蛋白质浓度和酶活力测定一 目的1、掌握醇脱氢酶活力的测定方法2、掌握蛋白质浓度的测定方法二 原理醇脱氢酶的辅酶NAD 它能催化乙醇脱氢变为乙醛，脱下的氢则使NAD+ 还原 . 当有过量醇存在时，NAD+ 被还原的速度与酶活成正比，酶活力越高， 单位时间产生的NADH越多 .NADH 对 340nm 紫外线有较强的吸收. NAD+ 无此能力 .因此可用测定A340 的方法测得反应体系中NADH 含量，从而得知酶活力的大小。
本实验用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量属于一种染料结合法考马斯亮蓝G-250 是一种蛋白染料它在游离状态下最大吸收波长为464nm由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力， 通过疏水作用与蛋白质相结合当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm这种结合在2 分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法但染料易吸附在比色杯上而造成误差， 每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇三 实验器材吸管 0. 1m1(× 1)，0.5ml(×2)，1ml(×3)，2ml( ×2)，5ml(×2) 量筒 100m1(× 1)容量瓶 1000m1(×1) 试管 1. 5cm×15cm(×8) 电子天平 . 722(或 7220 型)分光光度计四 实验试剂1、0. 06mol\ L 焦磷酸钠溶液(pH8.5)：称取焦磷酸钠22.56g 溶于蒸馏水，稀释至1000ml。
2、0. 0lmol/L 磷酸氢二钾溶液:溶 1.74g 磷酸氢二钾于蒸馏水并稀释至1000ml3、0.0015mol/L NAD溶液：称取NAD 0. 0995g ( NAD相对分子质量663.44)溶于蒸馏水并稀释至 1000ml. 4、考马斯亮蓝染液：取 0.10g 考马斯亮蓝G-250，溶于 50mL 95% 的乙醇中， 加入 100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL过滤待用该试剂于常温下可保存1 个月5、牛血清白蛋白(BSA) 标准液（ 0.1mg/mL ） ：精确称取0.2g 牛血清白蛋白，用0.9%NaCl 溶 液溶解后定容至2000mL， 4° C 保存6、0.9%NaCl 溶液五 操作1、蛋白质浓度的测定(1)标准曲线的制备：取7 支试管，按下表所示顺序操作混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm 处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度ug/ml 作为横坐标作图得标准曲线2)样液的测定另取试管，加入样品液1.0ml 及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量. 2、酶活力测定样液及酶制剂均需用0. 0lmol/L K2HP04溶液稀释，稀释倍数如下: V( 粗提取液 )：V(K2HP04)=1 ：4; V( 热变性去杂蛋白样液)： V(K2 HP04 ) =1 ：9; V( 有机溶剂去杂蛋白样液)：V(K2HP04>=1 ：9; V( 酶制剂 )：V(K2HP04)=1 ：9 吸取 0.06mo1/L 焦磷酸钠溶液0. 5m1， 3mol/L 乙醇溶液 0.1ml， 0. 0015mo1/L NAD 0. 1m1 ，蒸馏水 2. 2m1 置于石英比色杯中(容量 4ml)，加入已稀释的样液或酶制剂1ml，立即混匀，测定 A340，以后每隔15S 测一次，直至A340 不变，记下反应时间和A340 读数 . 于另一石英比色杯中以蒸馏水代替底物，作空白试验。
每分钟A340 增加 0. 001 为 1 活力单位3、结果将测得数据或计算结果填人表提纯酶时，常用此表，它反映了所采用的每一提纯步骤的效果实验三酵母醇脱氢酶离子交换柱层析实验四酵母醇脱氢酶的凝胶层析一、目的学习用凝胶层析技术纯化酶，并为动力学实验提供一定量的酵母醇脱氢酶二、原理本实验用Sephade- G100 纯化酵母醇脱氢酶三、实验器材1.层析柱 1cm× 90cm 2.恒流泵3.紫外检测仪4.部分收集器5.试管等普通玻璃器皿四、实验试荆1.、酶样品 :实验一经有机溶剂沉淀后的上清酶液2、葡聚糖凝胶Sephade-G100. 3、洗脱液： 0.05mol/I. Tris-HCl缓冲液4、冷冻干燥机五、操作1、凝胶的处理Sephade-G100.干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h，用倾泌法将悬浮在上层的较细颗粒除去，抽 干，用 10 倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用倾泌法除去悬浮的较细颗粒，备用2、装柱将层析柱垂直装好，关闭出口，加人洗脱液约lcm 高将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加人柱中，待底部凝胶沉积约1 cm 高时，再打开出口，继续加人凝胶浆，至凝胶沉积至一定高度(约 80cm ) 即可。
3、平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，用2- 3 倍床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/mim. 4、加样与洗脱将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将lml 样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2 次，加洗脱液至液层4cm 左右，按上恒流泵，调好流速(0. 5m1/min) ，开始洗脱5、收集与侧定用部分收集器收集洗脱液，每管 4m1.紫外检侧仪280 处检测 记录吸收值， 绘制洗脱曲线. 本实验在用280nm 检侧的同时需测定酶的活力大小，收集280nm 峰和活力峰重叠的区域.将收集液反复冷冻干燥得纯的酵母醇脱氢酶，用实验二的方法测定酶的比活力. 实验五酵母醇脱氢酶纯度鉴定一目的用聚丙烯酰胺凝胶垂直平析电泳鉴定酵母醇脱氢酶的纯度二 原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺，在催化剂作用下聚合而成的具有三维网状结构的大分子凝胶作为支持介质的一种区带电泳.它采用了凝胶，PH 值，缓冲液成分和电位梯度的不连续系统，因此具有高分辨率的效应，分子筛效应和电荷效应，在凝胶中对被分析的样品进行这种电泳时，样品中各成分首先经过浓缩，然后再根据各自所带的电花，分子的大小以及形状的差异以不同的迁移率电泳分离成带. 三 实验器材电泳仪重直平析电泳槽微量注射器染色与脱色缸移液器量筒和滴管1.5ml 离心管枪头 四 实验试剂1、分离胶缓冲液:1.5 M Tris·Cl（ pH 8.8） ：称取 18.15g Tris base 置烧杯中，加入80 mL 双蒸水充分搅拌溶解，用浓HCl 调 pH 至 8.8，定容至100 mL，4° C 保存。
2、1 M Tris·Cl（pH 6.8） ：称取 12.1g Tris base 置烧杯中，加入80 mL 双蒸水充分搅拌溶解，用浓 HCl 调 pH 至 6.8，定容至 100 mL，4° C 保存3、30%丙烯酰胺：称取29 g 丙烯酰胺， 1 g N ’N -亚甲双丙烯酰胺，加60 mL 双蒸水，加热至37° C 充分溶解，冷却至室温，定容至100 mL，4° C 避光保存，30 天以内使用 . 4、10%过硫酸铵（ AP） ：称取 1 g AP ，加适量双蒸水充分溶解，定容至10 mL ，4° C 避光保存5、10% 十二烷基硫酸钠（SDS） ：称取 5 g SDS，加 40 mL 双蒸水搅拌溶解，必要时置37° C 水浴促溶，定容至50 mL ，室温存放6、考马斯亮蓝R250 染液：在 45 mL 甲醇、 45 mL 水和 l0 mL 冰乙酸的混合液中溶解0. 25 g考马斯亮蓝R250，过滤去除颗粒状物质，室温存放7、脱色液： 45% (V/V) 甲醇和 10% (V/V) 冰乙酸混合溶液，室温存放8、2× SDS 加样缓冲液：1 M Tris·Cl（pH 6.8）1 mL β -巯基乙醇1 mL 10%SDS 4.0 mL 0.1%溴酚蓝2 mL 甘油2 mL 充分溶解后，定容至10 mL，4° C 保存。
9、电极缓冲液: pH8.3 Tris 3g ，甘氨酸14.4g， SDS 。