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1、酵母操作手册（一）酵母的冻存、复苏以及培养注：本手册改编自商业化酵母操作方案，依据本实验条件修改，并不适合所有实验室！培养基配方： 10X Dropout 粉剂（1L） AA Name所购数量 ( g )10X 浓度 (mg/L)实称 （g）L-Isoleucine53000.3L-Valine2515001.5L-Arginine HCl502000.2L-Lysine HCl503000.3L-methionine102000.2L-Phenylalanine105000.5L-Threonine1020002L-Tyrosine253000.3L-Uracil252000.2共计5.5将
2、各AAs称量后，在研钵中磨合混匀，置于干净器皿中。单独用AA筛选溶液 AA名称 体积 ( ml )浓度（mg/ml）实称 （g）L-Adenine hemisulfate salt10020.2100 XL-Histidine HCl monohydrate10020.2100 XL-Leucine100101100 XL-Tryptophan10020.2100 X过滤除菌YPDA（1L）浓度实称 （g）Difco peptone20 g/L20Yeast extract10 g/L10Agar (for plates only)20 g/L20Glucose2%20Adenine hemi
3、sulfate0.003%15 ml 0.2%AdeSD Media （1L）浓度实称 （g/ml）加H2O至1000ml, 114，20min。YNB6.7 gAgar(for plates only)20 gGlucose2%2010X基本DO 粉剂0.55 g100X单独用AA10 ml1 长期冻存： 无营养缺陷型的酵母株存在含25甘油的YPDA中，然后冻存于-70冰箱中，若要保存大于一年，务必使温度不要低于-55。 转染质粒的营养缺陷型酵母株存在含25甘油的相应的缺陷型培养基（SD）中，以避免质粒丢失。制备方法：用无菌牙签从琼脂板上将一个单克隆挑出，置于含200500lYPDA或SD的
4、1.5ml离心管中，注意尽量使牙签上的菌落都涮在溶液中，然后盖好盖，在旋涡器上剧烈振荡混匀，再加入无菌甘油，使其终浓度为25，再次振荡混匀，存于-70冰箱中。2 复苏：准备一无菌1.5ml离心管，加入100-200l YPDA或SD，用无菌牙签挑取些许冻存菌置于离心管中，稍微涮洗一下牙签（让挑取的冰屑融化），混匀后吸取100l涂平板，30培养23天。刚长出克隆的平板用封口膜密封后，在4可保存12个月。注意：有时冻存的酵母可能沉到离心管底部，所以在复苏时，将其全部融化，然后振荡混匀，再复苏。3酵母的液体培养：用无菌牙签挑取一个两个月以内的酵母克隆，每5ml液体培养基所需的克隆大小为23mm，所以
5、，如果单个克隆不够，可以多挑几个。剧烈振荡，使酵母细胞分散到液体中，30，200rpm振荡培养1618hr，但通常好像需要24hr，甚至更长才能达到稳定期（OD600 1.5），所以一般在上午开始摇，第二天下午收。如果需要中期培养物，则将上面的稳定期培养物稀释到OD600 = 0.2-0.3之间，然后30，200rpm振荡培养35hr，此时的培养物OD600 = 0.4-0.6之间。可见酵母的细胞周期约为35hr。（二）质粒转化酵母细胞手册试剂配方：单链Carrier DNA （SS-DNA）(2 mg/ml)注意：你不需要将Carrier DNA超声切割，因为实验证明Carrier DNA越
6、大效果越好！只要如下操作即可。1 称取200mg高分子量DNA（III型脱氧核糖核酸钠盐，鲑鱼精DNA，Sigma D1626），溶于100ml TE（10mM Tris.HCl, PH 8.0, 1.0mM EDTA）。先用10ml枪头吹吸使DNA湿化，然后用磁性转子于4缓慢搅拌过夜使其完全溶解；如果紧急，也可于室温剧烈搅拌2 3hr使其完全溶解。2 将其直接分装成1ml/管，储存在-20。3 使用之前，先取出一管沸水浴至少5分钟，然后迅速放置于冰上骤冷。要点： I：Carrier DNA沸水浴后可以用3至4次而不需要再次沸水浴。如果转化效率开始降低，请再将其沸水浴或重新换一管。II：本手册
7、中使用这种低浓度的Carrier DNA（2mg/ml）便于操作，并且重复性高。III：我们原来曾用酚：仿抽提来纯化这些Carrier DNA，以保证达到最好的转化效率。如果你购买的鲑鱼精DNA已是非常纯的，可以不用抽提。所以购买后先检测一下你的DNA的纯度。Carrier DNA无菌性要求：我们用灭过菌的TE缓冲液溶解DNA，所以在经过5分钟的沸水浴后，可以基本上认为它是无菌的。实验也证明了这一点。 1.0 M Lithium Acetate储液lithium acetate用去离子水溶解成1.0M，然后过滤除菌。没必要调节该溶液的pH值，该溶液配好后pH在8.4至8.9之间。 注意： Li
8、thium Acetate也可以通过高压20分钟来达到灭菌效果，但最好还是过滤除菌。PEG 3350 (50% w/v)PEG 3350购自Sigma公司，产品号为 P3640。将其用双蒸水或去离子水按 W/V = 50%溶解，然后过滤除菌。为了得到您满意的转化效率，务必注意PEG的浓度是否准确。另外，请将PEG溶液储存在密封性很好的器皿中，以防水分蒸发而导致PEG浓度上升。在正常手册中，PEG在转化体系中浓度为33（W/V），其浓度微弱的变化都可能导致转化效率达降低。 1取一150ml烧杯，加入50g PEG3350，然后加入35ml ddH2O。2磁子搅拌直至其溶解，这大约得花30分钟。3
9、将溶液转至100ml容量瓶或量筒中，注意用少量水清洗烧杯数次，将清洗液加入到容量瓶中，然后定容至100ml混匀。4用0.45m滤器过滤除菌，储存在灭过菌的器皿中。质粒DNA：质粒DNA可以用常规方法制备，转化酵母时没必要对其进行进一步的纯化。因为RNA在LiAc/SS-DNA/PEG转化过程中，RNA本身就是一个很好的载体（Carrier），所以不需要在制备DNA时除去RNA。我们在实验中常用碱裂解法大提质粒，但LiCl处理可以免去，TE中也不加RNase。常规转化酵母细胞手册 1将酵母接种在2 5 ml YPDA或10 ml 极限培养基中，于30、200rpm培养18至20h。2取少许在显微
10、镜下计数，使酵母浓度在108/ml左右。计数时注意： 1取少许酵母用水稀释10倍或100倍（假设为10倍）2小心地取10l置于计数板和盖玻片之间，使其虹吸进入两者中间的带格空隙中，静置几分钟。格子区域为1平方毫米，它被分为25个正方形，计数板和盖玻片之间的体积相当于104ml。3计5个正方形方格中酵母的数量（假设为239个）4按如下方法计数：5个方格中的酵母数 X 稀释倍数 X 1/25个正方形方格所占的体积。所以按3中所计之数，应该为239 X 5 X10 X 1/104 = 1.2 x 108个酵母/ml。5芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）通过芽殖来进行繁殖，计
11、数时出芽的酵母只能算是一个细胞，如果出的芽与原来的细胞等大，可以算作两个。有些酵母系会形成团块，导致铺平板时克隆数减少，因为一团细胞只能长成一个克隆，这使得下一步的分析变得困难。6我们也可以用OD600来确定酵母的浓度，但不同的酵母株中，这种细胞数与OD600之间的关系也不同。3取已在30预热的YPDA（50ml），加入2中的酵母细胞，使酵母浓度在5 x 106/ml。430，200rpm振荡培养，使酵母细胞浓度到2 x 107/ml。这大约得花3至5小时。这些培养物足可以做10个转化。注意：I：务必使细胞至少分裂两次II：转化效率（转化子/g质粒/108酵母细胞）在第3至第4个分裂期之间保持
12、稳定。5用50ml离心管于4，3000g（约5000rpm）离心5分钟。6倒去上清，用25ml无菌水重悬，再次离心。7倒去水，用1ml 100mM LiAc重悬，转移到1.5ml离心管中。8在微量离心机上，以最高速度（14,000rpm）离心15秒，用枪头小心将上清LiAc去除。9加入大约400l 100mM LiAc重悬细胞，使酵母细胞终浓度在2 x 109 /ml。注意：如果在步骤4中，酵母细胞浓度大于107 /ml，那就多加入一些LiAc，使步骤9中细胞终浓度保持在2 x 109 /ml。10取出一管Carrier DNA，沸水浴5分钟，迅速置于冰上骤冷。*没必要每次都将Carrier
13、DNA沸水浴，沸水浴后的DNA可以冻化3至4次，但记住每次拿出来的时候都要将其置于冰上*11将步骤9中重悬的细胞剧烈振荡，然后取出新的离心管，在每管中加入50 l（注意离心管上做好标记，以防混淆）。微量离心机上最高转速离心15秒，然后用200 l枪头将LiAc吸出。12按以下“转化混合物体系”，依次加入相应试剂：240 l PEG （50 W/V）36 l 1M LiAc50 l Carrier DNA （2.0 mg/ml）X l 质粒DNA （0.1 10 g）34 X l 无菌水总体积为360 l注意：此处的加入顺序非常重要，PEG必须得首先加入，它可以将酵母细胞与高浓度的LiAc分开，
14、使酵母免受高浓度之害。另外，也可将以上试剂（除了质粒DNA之外）预先混匀，然后在每管酵母沉淀上加入355l这种预混物（TRAFO），最后加入5l质粒DNA混匀。注意，TRAFO非常粘稠，所以一定要小心加入正确的体积数。13剧烈振荡，使酵母细胞与溶液完全混匀，这通常需要花1分钟。14置于30，于200rpm振荡培养30分钟。1542水浴中，热激30分钟。注意：不同的酵母细胞株，热激时间也可能存在不同。如果你需要高转化率，请先检测一下热激时间。16在微量离心机上，6-8000rpm离心15秒，用200l枪头小心去除上清。17小心、柔和地加入1ml无菌水，柔和地将沉淀细胞悬浮。注意：如果需要高转化效率，请尽可能地柔和。另外，清洗次数不宜再多，因为容易损失转化细胞。18取2至200l铺于极限培养基平板上，如果所取体积少于200l，另外再加一些无菌水使终体积至200l。注意：涂平板时，也尽可能柔和，用最少的划数使溶液平铺在整个平板上。19等溶液被完全吸收后，置于30培养2至4天。注意：转染两个质粒时，如含诱饵蛋白的质粒和文库质粒，可以同时将它们转入酵母中，但这样的转化效率会降低，因为只有大约3040的转化细胞可以同时含有两种质粒。所以，这种情况下，最好先将诱饵质粒转入酵母中（用本方法或快速转染的方法），然后再制备含该质粒的酵母感受态，来
